原核表达醛（糖）还原酶及霍乱毒素类似嵌合蛋白的研究

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1、Ｙ广东工业大学硕士学位论文（工学硕士）原核表达醒（糖）还原酶及霍乱毒素类似嵌合蛋白的研究周小芬二〇一五年六月１１８４分类号：学校代号：５ＵＤＣ：学号１２０６０３６：密级：２１１广东工业大学硕士学位论文（工学硕士）原核表达醛（糖）还原酶及霍乱毒素类似嵌合蛋白的研究周小芬指导教师姓名、职称：张媪（教授）杜志云（教授）学科（专业）或领域名称：化学工程与技术学生所属学院：轻工化工学院论文答辩日期：２０１５年６月ＡＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＳｕｂｍｉｔｔｅ

2、ｄｔｏＧｕａｎｇｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｆｏｒｔｈｅＤｅｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＥｎｉｎｅｅｒｉｎＳｃｉｅｎｃｅｇｙｇｇｇ（ＭａｓｔｅｒｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｃｉｅｎｃｅ）Ｐｒｏｋａｒｏｔｌｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅａｄｅｈｄｅｙｐ，ｙｒｅｄｕｃｔａｓｅａａｎｄｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｉｌａｒｔｏｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＭａｓｔｅｒＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＺｈｏｕＸｉａｏｆｅｎＳｕ

3、ｅｒｖｉｓｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＺｈａｎＫｕｎｐｇＪｕｎｅ２０１５ＦａｃｕｌｔｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＬｉｇｈｔＩｎｄｕｓｔｒｙＧｕａｎｇｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＧｕａｎｚｈｏｕＧｕａｎｄｏｎＰ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ５１０００６ｇ，，ｇｇ，摘要摘要本论文主要涉及了三个蛋白的基因克隆表达及相关抑制剂蹄选的研究，主要包括一与糖尿病综合症及炎症相关的酵糖还原酶和醛还原酶，以及种具有脑祀向作用的多亚基全新的霍乱毒素类似嵌合蛋白的

4、基因克隆表达和纯化，及采用醛糖还原酶和醛还原酶进行抑制剂的蹄选，主要得到的结果有以下三种。一还原酶家族第，酵糖还原酶（ＡｌｄｅｈｙｄｅｒｅｄｕｃｔａｓｅＡＫＲ１Ｂ１，ＥＣ１．１．１．２１）是酸酮。，成员，是多元醇通路的关键限速酶越来越多的研究发现ＡＫＲ１Ｂ１与多种疾病有关，一在系列的炎症性疾病等中起着关键作用，与多种炎症介质的产生有直接的关系，可作为蹄选非留体抗炎药物的新紀点。为了筛选相应的酶抑制剂，为药物开发及临床应－－用提供参考ＥＴ－２２ｂＡＫＲｌＢｌＨｉ，本研究构建了重组表达质粒ｐ（ｓ，将该质粒转化至

5、）６°ＲｏｓｅｔｔａＤＥ３主菌中，通过对表达条件的优化，确定表达条件为０．１７５ｍＭＩＰＴＧ、１４Ｃ、（）宿８０ｒｉｎｈ。９３％ｐ诱导１４，重组蛋白以可溶和沉淀两种形式表达采用亲和纯化得到纯度为－的ＡＫＲｌＢｌＨｉｓ）６融合蛋白。使用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎ蛋白质进行鉴定，蛋白质序列分析（ｇ仪测定氨基酸序列片段与目的蛋白序列比对－ｓ。利用体外酶动学方法测定ＡＫＲｌＢｌＨｉ（）６的比活力为（９．４±０．２３）Ｕ／ｍｇ。使用该蛋白建立酵还原酶抑制剂蹄选方法，分别测定已上－－ＮＳＡＩＤｓ市的１３种非留体

6、抗炎药（ＮｏｎＳｔｅｒｏｉｄａｌＡｎｔｉＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＤｒｕｇｓ，）对ＡＫＲ－ｌＢｌＨｉｓ的抑制活性。结果表明，萘普生、双氯芬酸、氟灭酸、布洛芬等对融（）６－Ｈ合蛋白ＡＫＲｌＢｌ（ｉｓ）６有较强的抑制作用，可与抗糖尿病并发症药物联合用药。（ＡｌｄｅｈｄｅｄｕｃｔｓｅＡＫＲＩＡＩＥＣｌ．１．２）是醛酮还薛还原酶ｅｒａ．１ｙ，原酶家族成员，能将有毒酸还原成相应的醇。为研究非体抗炎药对ＡＫＲ１Ａ１的抑制作用，为非绍体抗炎药的副作用及临床应用提供参考－－－，本研究构建了重组表达质粒ｐＥＴ２２ｂＨｉｓＤＤ

7、ＤＤ（）６Ｋ－ＡＫＲ１Ａ１ＲｏｓｅｔａＤＥ３，，将该质粒转化至（）宿主菌中，通过对表达条件的优化确定表°０２５ＩＰ１６Ｃ、８０ｒｍ１４ｈ。达条件为．ｍＭＴＧ、ｐ诱导，重组蛋白以可溶形式表达采用亲－ｓ－－ＡＫＲ和纯化得到纯度为９０％的ｅｌＢＨｉ６ＤＤＤＤＫｌＡｌ融合蛋白。重组蛋白用肠激酶ｐ（）－－ｈａｄｅｘＧ７５再次纯化特异性剪切ＮＴＡ、Ｓｅ，得到纯度为９８％的野生型ＡＫ，经过ＮｉｐＲ１Ａ１蛋白。使用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和蛋白质序列分析对蛋白质进行鉴定。利用体外酶－－动学方法测定（Ｈｉｓ）６ＤＤ

8、ＤＤＫＡＫＲ１Ａ１的比活力为４１．３±０．１Ｕ／ｍ、ＡＫＲｌＡｌ比活力（）ｇ１广东工业大学硕士学位论文为（７９．４±０．１５）Ｕ／ｍｇ。奥沙普秦、酮基布洛芬、氟灭酸、托芬那酸等对ＡＫＲ１Ａ１有很。强的抑制