人血白蛋白的原核表达及应用-论文.pdf

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1、生物技术通报·研究报告·BIoTECHNoLoGYBULLETIN2013年第11期人血白蛋白的原核表达及应用李向茸。冯若飞谢晶莹田伟杨妍梅。王丹马忠仁(1．西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，兰州730030；2．甘肃省动物细胞工程技术研究中心，兰州7300303．西北民族大学生命科学与T程学院，兰州730030)摘要：旨在构建人血白蛋白(HSA)基因的原核表达载体pGEX一4T一1rHSA，诱导表达后纯化重组HSA蛋白，制备多克隆抗体并对其进行鉴定。根据GenBank发表的HSA(NM一000477．5)的核苷酸序列设计合成1对特异性引物，以人胚肺二

2、倍体细胞的总RNA为模板，利用RT．PCR扩增HSA基因，将其克隆至pGEX．4T一1载体，构建重组原核表达质粒pGEX．4T．1．rHSA，经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行IPTG诱导表达，表达产物经变性、复性、亲和层析纯化后作为免疫原制备多克隆抗体，应用间接ELISA和Western—blot方法对所得抗体进行检测。结果表明，重组蛋白主要以包涵体的形式存在，分子质量为92kD；重组蛋白具有良好的反应原性和免疫原性；应用其制备的抗血清效价达到1：10000；纯化的多克隆抗体与血源人血清白蛋白和重组人血白蛋白均能产生特异性结合，具

3、有良好的生物学活性。关键词：人血清白蛋白原核表达包涵体多克隆抗体ProkaryoticExpressionandApplicationofRecombinantHumanSerumAlbuminLiXiangrong'FengRuofei’XieJingying3TianWei。YangYanmeiWangDanMaZhongren(1．TheKeyBio-engineeringandTechnologylaboratoryofNationalityCommission，NorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou7303

4、0；2．GansuEngineeringResearchCenterforAnimalCell，Lanzhou730030；3．LifeScienceandEngineeringCollegeofNorthwestUniversityforNationalities，Lanzhou730030)Abstract：ThisstudywasaimedtoexpressandpurifytheproteinofpGEX·-4T-1-rHSAinprokaryocytesandprepareanti·-HSApolyclonalantibody．TheHSAgenewas

5、amplifiedfromhumanembryolungdiploidtotalRNAbyRT—PCR，withprimersbasedonthepublishedHSA(NM_00047．5)sequenceinGenBank．thenitwasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX一4T一1toconstructarecombinantexpressionvectorpGEX一4T一1一rHSA．ThepGEX一4T一1一rHSAwastransformedintoEcoliBL21(DE3)．Thepurified

6、expressedproteinwasinjectedintoarabbitandthepolyclonalantibodywasthenprepared，whichwereidentifiedbytheindirectELISAandWestern—blotanalysis．Resultsshowedthattherecombinantproteinmainlyexistsintheinclusionbody，about92kDandithasgoodreactogenicityandimmunogenicity．TheELISAtiteroftheantise

7、rumwasapproximately1：10000．Western—blotanalysisrevealedthatthepurifiedpolyclonalantibodyagainstpGEX一4T一1一rHSAhadaspecificaffinityfornaturalhumanserumalbuminandtheexpressedprotein．KeyWOrds：HumanserumalbuminProkaryoticexpressionInclusionbodyPolyclonalantibody人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin，HSA

8、)广泛应用