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《... 醛脱氢酶gapdh的原核表达及其与热休克蛋白dnaj的》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、肺炎链球菌三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH与热休克蛋白DnaJ的相互作用研究马峰1、王建敏2、王丽滨2、宋志新2、徐红梅2、邢燕2、粟玉凤2、张雪梅2、孟江萍1(重庆医科大学附属第一医院1，重庆400016；重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室2，重庆400016)[摘要]：目的验证肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,S.pn）糖酵解关键酶三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)和热休克蛋白DnaJ的相互作用。方法PCR扩增S.pnD39GAPDH蛋白编码
2、基因gap全长，将其克隆至pET-28a(+)，重组质粒经PCR、双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导GAPDH-6His的表达，经Ni-NTA亲和层析柱纯化后，用SDS-PAGE鉴定其纯度。重组GAPDH蛋白经腹部皮下免疫昆明小鼠获得多克隆抗体。用westernblot鉴定GAPDH的保守性。采用大肠杆菌双杂交系统、直接结合实验、生物膜层干涉技术(Bio-layerInterferometry,BLI)验证GAPDH和DnaJ的相互作用。结果获得了纯度达90%的GAPDH重组蛋白，并获得了效价达107的抗GAPDH多克隆
3、抗体，westernblot显示在7株不同血清型S.pn的全菌裂解液和培养上清中均存在和抗GAPDH抗体反应的特异性条带。大肠杆菌双杂交系统显示GAPDH和DnaJ共转化菌株能够在3-AT平板及双选择培养平板上生长，提示二者在细菌胞内有相互作用。直接结合实验和BLI显示随着加入GAPDH蛋白浓度的增加，二者的结合量也增加，提示GAPDH和DnaJ的结合具有浓度依赖性。BLI实验也显示GAPDH和DnaJ的亲和常数为1.12×10-7M。结论糖酵解关键酶GAPDH在肺炎链球菌中保守表达，且为分泌性蛋白；该蛋白和热休克蛋白DnaJ在细胞内存在相互作用，且为
4、直接相互作用；本研究结果为揭示DnaJ对GAPDH分泌及毒力的影响机制奠定了坚实的基础。[关键词]:肺炎链球菌；三磷酸甘油醛脱氢酶；热休克蛋白DnaJ；蛋白相互作用；[中图法分类号]R372；R378.14；R394-33[文献标志码]AGAPDH,aGlycolyticEnzyme,InteractswithHeatShockProteinDnaJinStreptococcuspneumoniae14MaFeng1,WangJianmin2,WangLibin2,SongZhixin2,XuHongmei2,XingYan2,SuYufeng2,Zh
5、angXuemei2,MengJiangping1(基金项目：国家自然科学基金（No.81171532）通信作者：孟江萍，Tel：86-23-68485216；E-mail：mjlily2000@163.com作者简介：马峰，重庆医科大学2012级临床检验诊断学硕士（在读），主要研究肺炎链球菌的致病机制。Tel：18202354942；Email：shenfen123.hi@163.comFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,ChongQing,400016,China;2KeyLabo
6、ratoryofClinicalLaboratoryDiagnosticMedicineofMinistryofEducation,FacultyofLaboratoryMedicine,ChongQingMedicalUniversity,ChongQing,40016,China)[Abstract]:ObjectiveToinvestigatetheinteractionbetweentheheatshockproteinDnaJandglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH),akeyenzym
7、eofglycolytic,inStreptococcuspneumoniae(S.pn).MethodsThefull-lengthgeneofgapwasamplifiedbyPCRwithspecificprimersfromS.pnD39andthenclonedintotheexpressionvectorpET-28a(+).RecombinantpET-28a(+)-gapwastransformedintoE.coliBL21(DE3)andinducedwithIPTGtoexpresssixHis-taggedGAPDH.Theaf
8、finitychromatographycolumnwasusedtopurifyrecomb
