农杆菌介导的2mg_2-epsps基因转化玉米幼胚的研究

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1、分类号０９４３．２学号Ｓ２０１２１１３１＊‘ｔ四川巧业大学顾女学位论文农杆菌介导的基因转化玉米幼腥的硏究贾艾敏指导教师刘坚副巧巧学科专业生物化学与分子生物学研究方向植你墓因工程２０巧年４月ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＭａｓｔｅｒＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＡｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅ姐ａｔｅｄｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｇｇｏｆ－ＭａｉｚｅＩｍｍａｔｕｒｅＥｍｂｒｙｏｓｏｆ２ｍＧ２ｅｐｓｐ

2、ｓＪｉａａｉｍｉｎ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄＭｏｌｅｃ山ａｒＢｉｏｌｏ）ｙｇｙＤｉｒｅｃｔｂＬｉｕＪｉａｎｙＡｒｉｌ２０１５ｐ，论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取。得的成果尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学一或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并

3、表示了谢意。研究生签名；２＾炸居月ｎ曰１疋敏１关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，目Ｐ：学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可Ｗ用＾同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。＼＾文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。”（请在Ｗ上□内划叫）２研究生签名；＾月曰女年１＾导师签名巧＆月（少日摘

4、要作为世界上的第二大玉米生产国，我国玉米的种植面积和产量不断増加，目一大粮食作物前已超过水稻成为中国的第。中国玉米生产长期处于自给自足的平衡状态２０１０、２０口年中国先后成为玉米净进口国，我国在玉米进出口关系上，年。玉的转变，使提离国内玉米产量的任务更加紧迫米生长处于高湿、高湿季节，杂草危害严重，化学除草是消除杂草危害、保证玉米增产增收的重要除草方式。草甘麟作为目前使用范围最广的灭生性除草剂，在杀死杂草的同时，对农作物同一样具有杀死作用。通过植物基因工程育种使玉米获得草甘麟抗性，是解

5、决这矛盾的有效手段。ＩＡ３３０１－ｅｗｗ本研究通过酶切连接法改造植物表达载体ｐＣＡＭＢ；；，使抗草甘麟基因处于玉米泛素蛋白启动子之后，用农杆菌介导法转化玉米自交系－－ＴＯ１８５９９Ｒ及巧ＩＩ幼巧，。，并对幼化转化系统进行了优化获得了代转基因植株通过对转基因植株的ＰＣ民检测和测序验证，表明目的基因巧护已整合到玉米基因组中。主要结果如下；－１、植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１ｅｐｓｐｓ的改造。将ＰＣＡＭＢＩＡ３３０１上草甘麟基因前的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子换成玉米泛素蛋白后动子抓鸣Ｗ

6、＂加启动子。作为玉米自身基因的后动子，用它驱动外源基因转化玉米时，可Ｗ降低外源基因在转基因个体中的拷贝数，从而避免基因沉默现象的发生。２、玉米幼胚作为遗传转化的外植体，通过影响出愈率来影响农杆菌介导玉米＝－－转化效率．８２．０ｍｍ大小的幼，在菌液浓度为００６０００．４０．６，。本研究用０胚浸染－时间为１０ｍｉｎ的条件下进行处理，恢复培养后统计出愈率。结果显示，化８１．２ｍｍ、－－、７４％、３８％１．２１．５ｍｍ、１．５２．０ｍｍ时的出愈率分别为９３％，证明幼胚的大小为－０。

7、．８１．５ｍｍ时均可Ｗ作为农杆菌介导玉米遗传转化的受体３、浸染后在恢复培养基中使用４００ｍ／Ｌ的头抱来抑制农杆菌的继续生长，为ｇ。／Ｌ保证抗性愈伤组织的形成，筛选培养基中同样需要添加头抱实验中用２００ｍｇ、４００ｍｇ／Ｌ、６００ｍｇ／Ｌ的头跑进行处理，在１．２ｍｍｏｌ／Ｌ草甘麟筛选培养基中筛选１５天后统计抗性愈伤率，结果表明筛选培养基中仍使用４００ｍｇ／Ｌ的头袍才能保证较高的抗性愈伤率。４、菌液浓度、浸染时间及二者的交互作用均对浸染效率影响显著，按照两因Ｉ＝素Ｈ水平设汁９个处理，

8、Ｈ次重复。实验结果显示，茜液浓度ＯＤ６０００．６，浸染时间为１０ｍｉｎ好，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ草甘麟筛选１５天后的平均抗性愈伤率最高，为＝适当延长浸染时间来提髙浸染效率巧．３３％。菌液浓度为００６０００．４时，可。５－－－－、对１８５９９民和出ＩＩ１１８幼胚的农杆菌介导法进行比较，结果发现曲比１５９９民。更早形成愈伤，且愈伤组织增长速度更快，对草了麟的筛选也更快作出反