番木瓜蛋氨酸亚砜还原酶b1基因克隆表达及其活性检测

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1、学校代码：学号：分类号：密级：硕士学位论文题目番木瓜蛋氨酸亚砜还原酶基因克隆表达及其活■忡检测作者指导教师周鹏研究员专业农业生物技术时间二—五年五月Cloning，海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：期：匆夕年夕月学位论文版权使用授权说明本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，卩：学校有权保

2、留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。学校可以为存在馆际合作关系兄弟高校用户提供文献传递服务和交换服务。本人授权海南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编木学位论文。保密论文在解密后遵守此规定。论文作者签名：导师签名：期：如夕年月巧円円期年’本人已经认真阅读“校学位论文全文数据库发而章程”，丨意将木人的学位论文提交“髙校学位论文全文数彳库”屮全文发布，并可按“章程”屮规定享受相关权益。同意论文提交后滞后：￥卜年；口一年；口二年发布。论文作者签名：卜丨期：年摘要番木瓜环斑病毒是番木瓜种植业毁灭

3、性病害。本实验室前期工作己证明，感染导致了番木瓜植株体内活性氧的积累，多功能蛋白含个蛋氨酸残基，其中一个易被氧化成蛋氨酸亚讽。植物蛋氨酸亚砜还原酶能清除修复还原被氧化的蛋白蛋氨酸残基，从而保护植物进行正常光合作用。与番木瓜蛋氨酸亚砜还原酶互作干扰了定位于叶绿体，这些发现使我们推测，还原修复由于寄主防御而被氧化的，这可能是一种新的病毒反防御机制。为了得到具有生物活性的重组蛋白，本研究分别采用毕赤酵母真核表达系统和大肠杆菌原核表达系统对其进行重组表达，并检测其活性。毕赤酵母真核表达系统，将克隆出的基因转到表达载体上，成功构建了真核表达载体并在毕赤酵母中以分泌形式高效表达，取表达上清用琼脂糖亲和

4、层析柱纯化，得到浓度为的酵母重组蛋白。和分析，在处出现特异目的条带，说明成功表达了酵母重组蛋白。大肠杆菌原核表达系统，将克隆出的基因转到表达载体上，成功构建了原核表达载体，转入表达菌后，分别在°，°°°和°用的诱导，和，发现大肠杆菌重组蛋白是以包涵体形式表达，且最佳的诱导表达条件为°，的诱导。取培养液离心收集菌体，经超声波破碎后用的尿素变性，用琼脂糖亲和层析柱纯化，得到浓度为的大肠杆菌重组蛋白和分析，在处出现特异目的条带，说明成功表达了大肠杆菌重组蛋白。为了检测重组蛋白的生物活性，用氧化胁迫实验从体内证明了重组菌能抵抗氧化胁迫，诱导后的重组菌能抵抗氧化胁迫；人工化学合成用作薄层层析实验和反

5、相高效液相色谱分析，从体外证明了重组蛋白能将蛋氨酸亚砜还原成蛋氨酸，呈现还原酶活性。本研究结果可为进一步探究在番木瓜叶绿体中抗氧化机制奠定了良好的基础。关键词：番木瓜蛋氨酸还原酶毕赤酵母表达；大肠杆菌表达；纯化；活性检测AbstractPapayaringspotvirus(PRSV),amemberoftheaphid-transmittedgenusPotyvirus,isthemostwidespreadanddestructivevirusdiseaseaffectingpapayacultivationworldwide.ItwasdemonstratedthatPRSVinfe

6、ctionleadstotheaccumulationofROSpapayainvivo,andthevirus-encodedPRSVnuclearinclusionproteinaprotease(NIa-Pro)contains4Metresidues,oneofwhichispredictedtobeparticularlypronetooxidationintoMetsulfoxide(MetSO).PlantmethioninesulfoxidereductaseB1(MsrBl)protectsthephotosyntheticapparatusfromoxidativeda

7、magebyscavengingROStorepairMet-oxidizedproteins.Howeverthechloroplast-localizedpapayaPaMsrBlinteractswithinteractswithNIa-Pro,disturbingimportofPaMsrBlintochloroplasts.ThesefindingsledustohypothesizethatPaMsrBlca