火鸡组织滴虫体外分离培养体系和动物感染模型的建立及中药体外抑制研究

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1、分类号学号ＭＺ１２４９１ＵＤＣ密级壤叫义妻ＹＡＮＣＺＨＯＵＵＮＩＶＥ１湖ＴＹ醒若硕去学位冷文（专业型）火鸡绍织滴虫体外巧屬培养体系和动鞠感染模型的建立及中药体外抑制研究郭平指导教师姓名：许金俊副教授，扬州大学，江苏扬州，２２５００９：硕去学科专祉名称申请学位级别：善医硕壬论文提交日期：２０１５年４月抢文答辩日期：２０１５年６月学位授予单位；扬州大学学位授予日期：答辩委员会主席：２０１５年６月郭平；火鸡组织滴虫的体外培养和感染模型建立及中巧体外抑制的研究Ｉ火

2、鸡纪织滴虫体外分离培养体系和动物感染模聖的建立及中药体外抑制研究中文摘要。＂禽组织滴虫病（巧ｓｔｏｍｏｎｉａｓｉｓ）又称为传染性盲肠肝炎或黑头病，是由火鸡组织滴一种原生寄生虫病虫（Ｍｓ化／ｎｏｎｗ流ｙ）引起的鸡形目禽类的，Ｗ肝脏坏死、盲肠。，由邮大和排硫横样粪便为主要特征，在火鸡中尤为严重，可引起严重的经济损失目前于能够有效治疗和预防该病的化学药物具有潜在的致癌性而大多被禁止使用，导致该病近。年发生大规模传播和流行，给养禽业造成了严重的危害近年来，随着国内规模化生态圈养和放养等健康养殖技术的示范和推广，组织滴虫病在我国的流行和发

3、生也越来越严重，，而国内对相关研究并不多且不系统，因此，开展对火鸡组织滴虫及组织滴虫病的研巧研究该病的发病机制、药物防治及疫苗对于养禽业的健康发展具有重要意义。本研究首先对江苏地区的火鸡组织滴虫进行了分离，并，成功建立了火鸡组织滴虫体外分离培养的体系对该体系进行了优化；其次对分离的火鸡组织滴虫虫体进行单克隆培养并对纯化的虫株进行了冻存和复苏；用单克隆培养的虫体成功建立了动物感染模型；在体外研究了中药产品对火鸡组织滴虫的抑制作用。１．火鸡组织滴虫体外培养方法的建立立一为了研究火鸡组织滴虫的生物学特性，建种简单有效的火鸡组织滴虫体外培

4、养方一法非常重要。火鸡组织滴虫感染的主要器官是盲肠和肝脏，是种非常脆弱的微生物，在一旦随着粪便排出体外，脏器中和环境温度中裸露的虫体，只能够存活很短的时间所Ｗ火鸡组织滴虫的体外分离非常困难。本研究采用Ｍ１９９培养基可作为火鸡组织滴虫体外培养的营养培养基，分别，再加入胎牛血清或者灭活马血清Ｗ及米粉等组成基础培养基从盲肠和肝脏中分离虫体。将临床上剪碎的肝脏组织或盲肠内容物接种培养４８ｈ后，首先对培养产物进行形态学判定，再经ＰＣＲ鉴定。研究结果表明，用盲肠内容物分离培养时得到３＾者混合感染一种盲肠寄生原虫：火鸡组织滴虫，芽囊原虫和鸡四

5、毛滴虫，，难１＾获得单一种类虫体种类的火鸡组织滴虫虫体，火鸡沮织滴虫的体外分；从肝脏中分离时能获得单离培养宜从带有病变的新鲜肝脏组织中进行。２．火鸡组织滴虫体外培养体系的优化火鸡组织滴虫培养基包含Ｍ１９９培养基、米粉、灭活马血清及盲肠细菌，为建立最优’的培养体系。在４０Ｃ桓温培养箱中，本研究对培养条件及培养液的组成进行了系列优化ｎ扬州大学硕去学位论文５－３０个厌氧培养２天后火鸡组织滴虫的群体数量将会达到於１／ｍｌ，随后便会开始快速减少。实验过程中改变每９ｍｌ基础培养基中米粉的量０ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、６０

6、ｍｇ、８０ｍｇ、〇〇〇〇〇１００ｍ血清的种类：胎牛血清与灭活马血清０、５／〇、！０／〇、１５／〇、２０／〇、３０／〇、ｇ；：血清比例４０％与无氧培养条件的比较。巧利用新鲜的病变肝脏组织进行火鸡姐织滴虫分；Ｗ及有氧离培养，比较有盲肠细菌和无盲肠细茜的差别，最终获得了火鸡组织滴虫的最佳体外培养．体系。火鸡组织滴虫在９ｍｌ含９０％Ｍｌ９９培养基，１０％灭活马血清，１０ｍｇ米粉及含盲肠。细茜的基础培养基中生长良好，可培养获得稳定和高产量的火鸡组织滴虫虫体３．火鸡组织滴虫的体外单克隆及保存复苏采用体外分离培养技术对江苏地区采集的两

7、例典型病变的新鲜肝脏组织中火鸡组织一。滴虫进行了体外分离培养，获得了两个不同地区火鸡组织滴虫的虫体进步参照球虫单卵囊分离技术中的悬液法对火鸡组织滴虫进行了单克隆纯化，，获得两株火鸡组织滴虫分ＪＳＹＺ－Ａ和ＪＳＹＺ－Ｂ别命名为。然后将扩大培养的单克隆虫株放入液氮中长期冻存，并且对冻存的虫株成功进行了复苏。研究结果表明，建立的火鸡组织滴虫体外单克隆培养、冻存及复苏的方法切实可行，为开展虫体的病原学、致病机理队及燕窝和疫苗的研制奠定了很好的基础。４．火鸡组织滴虫体外动物感染模型的建立ＪＳＹＺ－ＡＰＦ采用单克隆培养的火鸡组织滴虫感染了Ｓ

8、黄羽鸡。研究了不同感染剂