表皮体外重建模型建立及性状的研究

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1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：￡丛日期：论文作者签名：i：!：：：!日期：中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的

2、规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：艄圜≯·中文论著摘要·表皮体外重建模型的建立及性状研究目的为了满足皮肤科学基础和临床发展的需要，近年来人们进行体外重建皮肤的各种尝试。在实验

3、室重建的皮肤，是由种子细胞或皮瓣在真皮替代物上进行诱导、发育、分化成类似在体皮肤的完整表皮，称为人工皮肤或皮肤替代物。这种人工皮肤一般应具有表皮和真皮双层结构并具备皮肤的生物学特征。随着种子细胞培养技术和真皮替代物的发展，人工皮肤不仅用于创伤(如烧伤)后皮肤的移植和修复，还可用于皮肤发育，皮肤病发病机理等的研究，有着广阔的应用前景。多年来人们期望在体外建立一种能够模拟在体皮肤损伤修复过程的模型，即损伤边缘角质形成细胞分裂增殖，向创面移行，最后覆盖创面，新生表皮完成修复和重塑的过程。这一过程涉及到与表皮发育相关的细胞增殖、迁移和分化

4、三个重要步骤。对这一过程的研究可以帮助了解和深入研究与皮肤发育和修复相关的诸多问题，从而具有潜在的基础理论价值和实际应用前景。为此，本研究应用器官型培养技术，利用去表皮的真皮组织(de—epiderⅢizeddermis，DED)作为真皮替代物，拟建立一种以观察表皮发育并以荧光素跟踪测量表皮生长的皮肤体外重建模型，用于研究表皮的修复以及生物、药物等因素对表皮发育的影响。材料和方法一、真皮替代物制备及器官培养1、去表皮的真皮组织(DED)制备：健康成人皮肤标本用PBS清洗数次，将标本表皮向下，真皮向上平展于超净工作台的平台上。在解剖

5、显微镜下用眼科弯剪仔细去除皮下组织，至到约2．5ram厚，用10nun的活检器取材，将取下的标本浸于PBS中，然后置于560C的水浴箱中30min,取出后将表皮与真皮分离，去除表皮。将真皮部分(DED)置于平皿中室温下约1h将其凉干，后放置于聚乙烯塑料瓶中，加一滴DMSO，封闭瓶盖，迅速置入液氮(．120～．160)中约5～7min，取出后于室温放置30min,然后再置入液氮中。这样连续反复10个循环，将DED中细胞成分杀死。后将其放入-760C冰箱中备用。2、支撑架的制备：为使表皮组织能在空气一液面培养，将70p,m目筛的细胞过

6、滤器修剪成培养支撑架，放入6孔培养皿的培养孔中。培养液能够通畅地穿过孔筛，保障表皮组织在接触空气的液面生长。3、微小皮瓣的制备：取健康人正常皮肤，用PBS清洗数次，置于超净工作台，自然平展标本，用2mm活检器取样，在解剖显微镜下用剪7J,J,心去除皮下组织及深层真皮，保留浅层真皮组织，然后将标本的真皮面轻沾混合组织胶，表皮部分朝上，真皮部分朝下，置于DED上。然后将DED移至六孔培养皿的支撑架上，每孔加约5ml基础培养液，空气一液面培养，争3天换液一次。4、培养液配制：基础培养液为DMEM与F．12营养液3：1混合，胰岛素(5pg

7、／m1)，腺嘌磷(O．18mM)，氢化考的松(O．5pg／m1)，霍乱弧菌毒素(1040M)，链霉素(100¨∥IIll)，青霉素(100units／m1)，1％非必需氨基酸，1096胎牛血清。根据实验需要添加其它成分。二、组织结构及分化标记物检测1、组织结构检测：用光镜，透射及扫描电镜观察DED及新生表皮组织结构及超微结构。与此相关的组织染色包括苏木素一伊红染色，过碘酸雪夫氏染色，苦味酸一酸性品红染色，间苯二酚一碱性品红染色，苦味酸一酸性品红与问苯二酚一碱性品红双染色等。2、免疫组化检测：与细胞增殖相关的检测包括：Ki67抗原，

8、5一溴脱氧尿嘧啶核苷，Hoeehst33258；与细胞分化相关的检测包括：角蛋白一1，角蛋白一14，包膜蛋白，beta-1整合素，谷氨酰胺转移酶一1；与组织或细胞鉴定相关的检测包括：V'maentin,IV型胶原，CDla,Mel．5，板层素等。三