河南省prv血清学调查及鉴别野毒疫苗毒株二重fq-pcr方法的建立

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1、分类号UDC密级编号专业硕士学位论文河南省PRV血清学调查及鉴别野毒/疫苗毒株二重FQ-PCR方法的建立TheserologicalinvestigationofswinepseudorabieandestablishandapplicationofFQ-PCRtoidentifywildvirusorvaccinestrainofporcinepseudorabievirusinHenanProvince学位申请人：杨雯慧指导教师：闫文朝副教授合作教师：吴志明研究员专业领域：兽医学位类别：兽医硕士2015年04月独创性声明本人声明，

2、所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：摘要摘要为了更好的了解河南省猪伪狂犬的流行状况，本次调查通过对本实验室2007-2014年以来血清学数据进行汇总，按照不同时间、不同地区、不同生长阶段猪群划分，从时间、空间、畜间三个角度全面分析近几年河南省PR的流行趋势

3、。比较分析得出：2007年-2010年河南省猪伪狂犬gE抗体阳性率呈逐年下降趋势，但在2010年以后河南省猪伪狂犬gE抗体阳性率持续升高；将2014年检测1373头猪血清抗体数据，按照区域划分为豫东、豫西、豫北、豫南、豫中5个地区，结果显示豫北地区PRV野毒感染率高达66.67%，其次是豫中和豫南地区分别59.51%、53.9%；将2014年766头背景清晰的血清学数据，按照猪不同饲养阶段进行分群，得出母猪和后备母猪的阳性率分别高达64.21、50%，其次是育肥猪野毒的阳性率为49.01%。虽然疫苗的免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根

4、本措施，但近几年PR仍呈高爆发趋势，因此如何鉴别野毒和疫苗毒株感染成为了一个重要的问题。本研究根据GenBank中PRV-gD/gE基因序列，选取高度保守序列设计2对特异性引物和2条MGB探针。采用矩阵法筛选最佳引物和探针浓度，优化最佳退火温度。分别对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性、重复性和稳定性试验，并对疑似PRV感染的疑似样品进行临床应用性试验，同常规PCR方法进行了对比。结果显示，经过优化后的最佳引物浓度组合PRV-gE/p1、PRV-gD/p1/p2均为0.7μmol/L，PRV-gE/p2为0.8μmol/L；探针分别为P

5、robe-PRV-gE为0.4μmol/L、Probe-PRV-gD为1.4μmol/L；最佳退火温度为60℃。pGEM-T/PRV-gE最低检出限均为1×101拷贝/μL，灵敏度为常规PCR的10倍；pGEM-T/PRV-gD最低检出限为1×102，灵敏度为常规PCR相同。对9种病毒和3种疫苗进行特异试验，结果表明该方法具有良好的特异性，而且可以对野毒株和疫苗毒株进行鉴别。将pGEM-T/PRV-gE和pGEM-T/PRV-gD质粒等体积混合均匀，对1×107、1×105、1×102拷贝/μL分别进行3次重复，表明该方法具有较好的重

6、复性；对以55份临床疑似阳性样品分别进行二重FQ-PCR和常规PCR检测，二重FQ-PCR检出阳性样品30份，其中双阳性基因19份，gD阳性11份，常规PCR检出阳性样品25份，其中双阳性15份，gD阳性10份。结果显示，二重FQ-PCR比常规PCR方法阳性样品检出率高比常规PCR更灵敏。成功建立了鉴别猪伪狂犬病野毒株与疫苗毒株的二重FQ-PCR的方法。通过检测gD扩增结果阳性，gE扩增结果阴性，则判定为PR疫苗毒株感染；gD扩增曲线为阳性，同时gE也为阳性的则I摘要判定为PR野毒感染。本方法的建立，不仅可以用于PRV早期病毒感染诊断

7、，而且同时能够鉴别野毒株/疫苗毒株感染，对PRV的防制和净化具有重要意义。关键词：猪伪狂犬；血清学；二重荧光定量PCR；野毒株；疫苗毒株；鉴别论文类型：研究型选题来源：自选IIABSTRACTABSTRACTInordertohaveabetterunderstandingofthespreadofPRinHenanprovince，thisstudy，basedontheserologicalstatisticscollectedduringtheyearsfrom2007to2014inourlab，triedtogrouppig

8、sintermsoftimeandplaceofbirthandphaseofgrowthandanalyzethedatafromtheperspectivesoftime，spaceandlivestock.Thec