漏芦水提物通过调节PAK4影响人肝癌细胞HepG2的细胞活力.pdf

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1、成都中医药大学2018届硕士学位论文（临床医学院）二0一八届硕士研究生学位论文漏芦水提物通过调节PAK4影响人肝癌细胞HepG2的细胞活力UniflowerSwisscentauryRootWaterExtractImpactVitalityofHepatocellularCarcinomaCellLinesHepG2byRegulatingPAK4研究生姓名：邬逸芳指导教师：钟森教授涂翔副主任医师学科专业：中西医结合临床（感染）二○一八年五月1成都中医药大学2018届硕士学位论文.学位论文漏芦水提物通过调节PAK4影响人肝癌细胞HepG2的细胞活力U

2、niflowerSwisscentauryRootWaterExtractImpactVitalityofHepatocellularCarcinomaCellLinesHepG2byRegulatingPAK4邬逸芳指导教师姓名：钟森教授涂翔副主任医师申请学位级别：硕士专业名称：中西医结合临床论文提交时间：2018年4月论文答辩时间：2018年5月二○一八年五月2成都中医药大学2018届硕士学位论文本研究来源于2015年立项的四川省科技厅支撑计划课题课题名称：中医治疗肿瘤的转化医学平台建设课题编号：2015SZ0038课题负责人：钟森教授课题组成员：

3、涂翔副主任医师3成都中医药大学2018届硕士学位论文中文摘要研究背景及实验目的：根据世界卫生组织报道，癌症是全球第二大死因，2012年约有1400万新发癌症病例，2015年造成880万例死亡，其中肝癌位居第二位（78.8万例死亡）[1]。在中国，肝癌每年新发病例数为36.6万人，每年死亡病例数为32.1万，位居全国癌症死亡第二位。肝癌约有80%-90%是原发性肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）,目前运用于临床的治疗原发性肝细胞肝癌的方法主要有：手术切除及微创介入治疗、放疗、化疗及生物细胞免疫疗法、中医药等综合治疗。中医

4、药在治疗原发性肝癌中有巨大的发展空间，根据临床观察及报道，肝癌患者治疗过程中配合中医药，可以延长生存期，提高生命质量。而在中药及其提取物中发现有效抗肿瘤细胞增殖及侵袭的成分并阐明其分子作用机制，成为新药研发发展方向之一。漏芦作为清热解毒类中药的代表药物之一，在原发性肝癌的临床中医药治疗中，被广泛应用并取得相关的经验支持和部分实验支持；相关药理实验表明，噻吩类化合物存在于漏芦中，此类化合物能够对于肿瘤多药耐药有逆转作用，并且对于肿瘤细胞的凋亡有诱导，因此肿瘤的化疗效果会提高。但对于其抗肿瘤细胞增殖及侵袭的内在分子作用机制仍为未明确。本课题组前期研究表明，

5、flila-EGFP转基因斑马鱼新生血管可以被漏芦水提物所抑制，其作用机制与促进TIE1的基因表达从而负反馈调节ANGPT-TIE信号通路相关[2]。肝细胞肝癌是一个涉及多基因、多位点、多通路改变的渐进过程。PAK家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，进化保守，是Rho家族特别是小鸟苷三磷酸酶Cdc42，Rac和Rho下游重要的靶蛋白，可被细胞外信号活化，参与调节细胞骨架、细胞凋亡、细胞周期及有丝分裂、基因转录调节和血管生成等生物学功能，在肿瘤的发生、侵袭与转移过程中可发挥重要作用。PAK4（p21-activatedproteinkinase4）属于PA

6、K家族，在多种肿瘤中如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、甲状腺癌、绒毛膜癌中高表达或异常活化[3-7]。本课题探讨选用人肝癌细胞HepG2，采用漏芦水提物处理该细胞，观察HepG2细胞的生长情况，观察HepG21成都中医药大学2018届硕士学位论文细胞活力及增殖等情况，并结合相关基因组生物信息学，进行高通量转录组测序，即RNA-seq，进行分析数据，分析相关基因的差异表达，筛选出肿瘤相关基因PAK4，研究其内在的分子机制，为漏芦作为抗肝癌药物提供客观的实验依据。实验方法：1.使用传统煎煮药物及干燥浓缩的方法，将漏芦生药3次煎煮后混合收膏并干燥打粉作为实验

7、用药。2.漏芦水提物对HepG2的细胞活力检测实验。分别以不同浓度的漏芦水提物（1.00E+00，1.00E-01，1.00E-02，1.00E-03，1.00E-04，1.00E-05，1.00E-06，1.00E-07，8个工作浓度的漏芦水提物培养基）处理HepG2细胞，采用CellTiter-Glo细胞活力检测法检测漏芦水提物对HepG2细胞的抑制率，并计算其半数抑制浓度IC50。3.基因的高通量分析RNA-seq：利用基因芯片法（RNA-seq）对漏芦水提物处理后的HepG2细胞进行检测，并分别计算基因水平和转录本水平表达差异情况，筛选出的样品

8、间或组间差异表达基因。4.以漏芦水提物（0.29mg/ml，IC50）处理HepG2细胞72小