垂盆草醇提物对人肝癌细胞hepg2的抑制作用及其

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1、垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其【摘要】目的：观察垂盆草醇提物(CCTT法测定CCyc基因及蛋白水平的影响。结果：HepG2细胞的增殖在CCyc的mRNA及蛋白水平的表达。结论：CC期，这可能与cMyc基因表达的下调密切相关;CCI1640培养基(Invitrogen公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，BiozolRNA提取剂(BioFlux公司)，MMLV酶、TaqDNA聚合酶(Promega公司)，VEGF、cMyc和βactin引物由InvitrogenBiotechnologyCo.,L

2、td.(上海)合成，兔抗人VEGF、cMyc抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒、DAB检验试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱MCO15AC(Sanyo公司)，真空冷冻干燥机(MatinChrist公司)，酶标仪(BioTek公司)，PTC200PCR仪(BioRad公司)，GelDocEQ图像分析仪(BioRad公司)，FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickson公司)。　　1.2方法　　1.2.1垂盆草醇提物的制备垂盆草干草500g，于95%的乙醇5000

3、ml中浸泡5d，纱布过滤，收集药液。重复2次，合并药液，离心取上清，所得上清液经减压蒸发挥去溶剂，再用石油醚经索氏提取法去除脂类，挥去石油醚,再用甲醇溶解，减压蒸干得醇提物。　　1.2.2细胞培养人肝癌细胞HepG2于含10%小牛血清、青霉素100U·ml-1、链霉素150μg·ml-1的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。　　1.2.3细胞增殖能力的检测将肿瘤细胞培养至对数生长期，计数，调整细胞浓度为1×105ml-1，接种于96孔板，80μl·孔-1，3h贴壁后加入终质量浓度分别为25、50、100、200μ

4、g·ml-1的CCSO对照组，每组设6个平行孔，将培养板置5%CO2、37℃培养箱中培养24、48、72h后MTT法检测[9]。　　1.2.4流式细胞术检测细胞周期取对数生长期细胞调成浓度为2×105ml-1，300μl·孔-1接种于24孔培养板中，细胞贴壁后加入质量浓度分别为50、100、200μg·ml-1的CCSO的同体积培养液，设4个复孔。分别收集对照组和醇提物各剂量作用48h后的HepG2细胞1×106个，70%乙醇4℃固定过夜，PBS清洗，加入含2%TritonX100、50μg·ml-1RNaseA的PI溶液，4℃避光

5、染色30min,上机检测2×104个细胞，用DI分析软件分析结果。　　1.2.5RTPCR检测肝癌细胞的VEGF和cMyc的mRNA水平用Biozol试剂分别提取各组HepG2细胞的总RNA，得到白色沉淀,加入1‰DEPC水30μl至RNA完全溶解并测定RNA的浓度和纯度。取各组总RNA各2μg分别进行逆转录合成cDNA。PCR反应体系总体积为25μl，其中含cDNA1μl，10×buffer2.5μl、MgCl2(25mmol·L-1)2μl、dNTP(10mmol·L-1)0.4μl、引物0.8μl、TaqDNA聚合酶(1U·

6、L-1)1μl。VEGF、cMyc和内参βactin基因引物序列分别参照有关文献[1012]。94℃预变性5min;然后94℃30s变性、58℃40s退火、72℃30s延伸，共30个循环;最后72℃延伸7min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪分析结果。　　1.2.6免疫细胞化学法检测VEGF、cMyc蛋白表达将HepG2细胞贴壁于预先置于6孔板的盖玻片上，加入不同质量浓度(25、50、100、200μg·ml-1)CCSO的培养液作为对照，37℃、5%CO2培养48h后取出玻片，PBS清洗标本2次，80%丙酮醇4℃固定

7、15min，染色步骤按SABC试剂盒说明书操作，PBS代替一抗作阴性对照。染色结果以细胞浆或核出现棕黄色高出背景的细胞为阳性细胞,每组随机选取10个高倍视野，计算每组的阳性细胞率(阳性细胞数占视野内总细胞数的百分比)。　　1.3统计学处理　　采用SPSS10.0软件进行统计学分析,实验数据以x-±s表示,F检验方差齐性后t检验进行组间比较,P<0.05为差异具有统计学意义。　　2结果　　2.1CCW对HepG2细胞增殖的影响　　CCW对HepG2的增殖抑制效果随着药物作用时间的延长而逐渐增强，在作用24h和48h后，最高浓度组抑

8、制作用具有统计学意义(P<0.05)，随着药物作用时间的增加，在72h各浓度组均有明显的抑制增殖作用(P<0.001)。见表1。表1CC期细胞的数量[分别为(15.46±2.7)%、(14.20±1.41)%