垂盆草醇提物对人肝癌细胞hepg2的抑制作用及其机制初探

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1、垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其机制初探【摘要】目的：观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌细胞HepG2生长及其肿瘤相关分子指标的影响。方法：MTT法测定CCW对HepG2细胞增殖的作用;流式细胞术观察细胞周期的改变;分别用RTPCR及免疫细胞化学法检测CCW对VEGF、cMyc基因及蛋白水平的影响。结果：HepG2细胞的增殖在CCW作用的第24、48和72h均被显著地抑制;CCW(100、200μg·ml-1)可使HepG2细胞阻滞于G0/G1期;CCW可显著下调VEGF、cMyc的mRNA及蛋白水平

2、的表达。结论：CCW对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用，并且能阻止细胞进入G2/M期，这可能与cMyc基因表达的下调密切相关;CCW能抑制HepG2细胞的VEGF分泌，初步推测CCW具有抗血管生成作用。【关键词】垂盆草;肝癌;抗增殖;细胞周期;抗血管生成垂盆草(SedumsarmentosumBunge)又称卧茎景天，系景天科多年生草本植物，分布于全国大部分地区。垂盆草主要含有垂盆草苷类、黄酮类、三萜类、甾醇、生物碱及糖类。此药性凉，味甘、淡，新鲜或干燥全草入药，主要用于治疗湿热黄疽、小便不利、痈肿疮疡，并且具有抑制

3、炎性渗出，减少肝细胞损伤，降低血清丙基酸氨基转移酶水平，治疗急、慢性肝炎等功效[1]。近年来，国内外大量研究表明，慢性病毒性肝炎与肝癌(hepatocellular14carcinoma)的发生有着密切的联系[23]，一些传统中草药中的黄酮、生物碱及多糖等成分在抗肿瘤、延长患者生命等方面有着独特的生物活性，不仅能够抑制肿瘤细胞增殖，还能有效抑制血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)和原癌基因cMyc的表达[47]，而VEGF和cMyc在肝癌的形成、生长、浸润、转

4、移过程中均发挥着重要的作用[8]。因此，本研究着重观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌细胞HepG2生长及肿瘤相关基因VEGF和cMyc表达的影响。　　1材料与方法　　1.1材料　　垂盆草购于江苏省药材公司。MTT、蛋白酶(Sigma公司)，RPMI1640培养基(Invitrogen公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，BiozolRNA提取剂(BioFlux公司)，MMLV酶、TaqDNA聚合酶(Promega公司)，VEGF、cMyc和βactin引物由InvitrogenBiotechnolog

5、yCo.,Ltd.(上海)合成，兔抗人VEGF、cMyc抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒、DAB检验试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱MCO15AC(Sanyo公司)，真空冷冻干燥机(MatinChrist公司)，酶标仪(BioTek公司)，PTC200PCR仪(BioRad公司)，GelDocEQ图像分析仪(BioRad公司)，FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickson公司)。14　　1.2方法　　1.2.1垂盆草醇提物的制备垂盆草干草50

6、0g，于95%的乙醇5000ml中浸泡5d，纱布过滤，收集药液。重复2次，合并药液，离心取上清，所得上清液经减压蒸发挥去溶剂，再用石油醚经索氏提取法去除脂类，挥去石油醚,再用甲醇溶解，减压蒸干得醇提物。　　1.2.2细胞培养人肝癌细胞HepG2于含10%小牛血清、青霉素100U·ml-1、链霉素150μg·ml-1的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。　　1.2.3细胞增殖能力的检测将肿瘤细胞培养至对数生长期，计数，调整细胞浓度为1×105ml-1，接种于96孔板，80μl·孔-1，3h贴壁后加入终质

7、量浓度分别为25、50、100、200μg·ml-1的CCW，同时设0.1%DMSO对照组，每组设6个平行孔，将培养板置5%CO2、37℃培养箱中培养24、48、72h后MTT法检测[9]。　　1.2.4流式细胞术检测细胞周期取对数生长期细胞调成浓度为2×105ml-1，300μl·孔-1接种于24孔培养板中，细胞贴壁后加入质量浓度分别为50、100、200μg·14ml-1的CCW，对照组加含0.1%DMSO的同体积培养液，设4个复孔。分别收集对照组和醇提物各剂量作用48h后的HepG2细胞1×106个，70%乙醇4℃固

8、定过夜，PBS清洗，加入含2%TritonX100、50μg·ml-1RNaseA的PI溶液，4℃避光染色30min,上机检测2×104个细胞，用WinMDI分析软件分析结果。　　1.2.5RTPCR检测肝癌细胞的VEGF和cMyc的mRNA水平用Biozol试剂分别提取各组HepG2细胞的总RN