ub-hbcag-ctp融合蛋白诱导特异性细胞毒性t淋巴细胞反应的实验研究

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1、上海交通大学博士学位论文Ub-HBcAg-CTP融合蛋白诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应的实验研究博士研究生：宋琳琳学号：0127259322导师：臧国庆专业：内科学（感染病学）研究方向：慢性乙型肝炎的免疫治疗申请级别：博士培养单位：上海交通大学附属第六人民医院基金项目：国家自然科学基金面上项目（81270502）上海市自然科学基金（11ZR1427100）答辩日期：2015年4月30日DissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityforthedegreeofPh.DThe

2、experimentalstudyofspecificcytotoxicTlymphocytesresponseinducedbyUb-HBcAg-CTPfusionproteinPh.Dcandidate:LinlinSongStudentID:0127259322Supervisor:GuoqingZangMajor:InternationalMedicine(InfectiousDiseases)ResearchField:ImmunotherapyofChronichepatitisBAffiliated:Shang

3、haiJiaoTongUniversityaffiliatedtoSixthPeople’sHospitalFundProject:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81270502)NaturalScienceFoundationofShanghai(11ZR1427100)DateofDefence:April30,2015上海交通大学博士学位论文Ub-HBcAg-CTP融合蛋白诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应的实验研究中文摘要慢性乙型肝炎仍是严重危害人类健康的疾病，现今全球

4、大约有3.5亿人感染乙肝病毒（hepatitisBvirus,HBV）。目前采取的治疗方法，均不能彻底清除病毒而使病毒持续存在于肝细胞内，造成感染慢性化，并可继发肝硬化、肝细胞癌。机体清除HBV感染起关键作用的是HBV特异性细胞毒T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocyte，CTL）。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasomesystem,UPS）是一种高度选择性的蛋白降解系统，它广泛存在于真核细胞内，并依靠ATP酶而起作用，对维持细胞乃至整个生物体的正常生理功能具有重要的作用。泛素化的抗原蛋白被蛋

5、白酶体复合物识别后被降解为若干小肽段，与主要组织相容性复合体-I（majorhistocompatibilitycomplex，MHC）类分子结合后被抗原提呈细胞识别，诱导特异性CTL反应。目前有许多研究表明，泛素化的抗原进入细胞后可被UPS系统有效降解及提呈，从而增强抗原诱导的免疫应答。正常情况下，由于膜屏障的存在，蛋白、多肽等很难进入细胞内，某些蛋白具有很强的不依赖于受体的跨膜活性，这类短肽被称为细胞穿透肽（cellpenetratingpeptide，CPP）。目前应用最为广泛的细胞穿透肽是HIV-Tat（humani

6、mmunodeficiencyvirustransactivatoroftranscription，HIV-Tat）蛋白。PTD（proteintransductiondomain）是Tat蛋白行使跨膜功能的核心片段，包含该区段的蛋白具有穿透细胞膜的功能。胞浆转导肽（cytoplasmictransductionpeptide，CTP）为PTD的衍生体，是一种新型的转导肽系统，它去除了核定位信号而能携带蛋白类大分子穿越细胞膜并专一性定位于胞浆中的。本研究通过构建Ub-HBcAg-CTP融合基因表达质粒，并进行蛋白的表达及纯化

7、，利用Ub-HBcAg-CTP融合蛋白体外刺激树突状细胞（dendriticcell，DC）成熟并诱导特异性CTL，体内免疫BALB/c小鼠，对Ub-HBcAg-CTP融合蛋白诱导特异性CTL的免疫功能进行了探讨。实验共分三部分：（1）Ub-HBcAg-CTP融合蛋白的表达、纯化及其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟的研究；（2）Ub-HBcAg-CTP融合蛋白促进T淋巴细胞增I上海交通大学博士学位论文殖，诱导特异性CTL反应的体外研究；（3）Ub-HBcAg-CTP融合蛋白免疫BALB/c小鼠诱导特异性CTL反应的体内研究。

8、II上海交通大学博士学位论文第一部分Ub-HBcAg-CTP融合蛋白的表达、纯化及其体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟的研究目的：构建Ub-HBcAg-CTP融合基因的原核表达载体，并进行蛋白的表达及其纯化，体外观察其对诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟的作用。方法：以质粒pcDNA3.1(-)-