afp158166特异性t细胞检测及体外诱导实验研究

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1、分类号：R657．3密级：学位类别：科学学位口专业学位团学校代码：10062学号：2010602290学科门类：医学又坪量斜矢号硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：AFPl5&166特异性T细胞的检测及体外诱导的实验研究TITLE：DetectionandinvitroinductionofAFPlss．166-specificTCells一级学科：临床医学二级学科：外科学普外论文作者：张振松指导教师：何向辉教授导师组成员：赵娜助理研究员天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明

2、：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：茎篷盏壁整日期：二p一浑舌月fEl学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或

3、机构送交论文，并编入有关数据库。保密lI，在年解密后适用本授权书。本论文属于r。。1不保密凹。(请在以上方框内打“√”)作者签名：兰篷亟整日期：2。-弓年6月／El导师签名天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：检测肝细胞癌患者外周血AFPl58-166特异性T细胞比例，并利用健康志愿者外周血淋巴细胞，体外诱导AFPls8．166特异性T细胞，为肝癌的免疫治疗奠定基础。方法：1、采用FITC荧光标记的HLA．A2抗体及HLA．A2基因分型高分辨检测试剂盒(PCR-SSP)，筛选HLA-A0201患者。取外周血，密度梯度离心法分离

4、获取外周血单个核细胞(PBMC)，流式细胞技术检测T细胞亚群；通过R-PE标记的MHC．AFPl58．166肽五聚体，流式细胞技术检测患者外周血中AFPl58．166特异性T细胞的比例。2、筛选HLA．A0201的健康志愿者，分离PBMC，按如下两种方法分别刺激特异性T细胞增殖。(1)培养T2杂交瘤细胞，负载HLA．A0201抗原表位肽AFPl58．166，Y射线照射(75Gy)处理，与PBMCl：1混合，反复刺激，IL-2维持。(2)以含人GM．CSF、IL．4及TNF．Q细胞因子的培养基培养PMBC，贴壁粘附培养法培养收获

5、树突状细胞(DC)，将DC负载HLA．A0201表位肽AFPl58．166，与新鲜淋巴细胞以1：10比例混合，含细胞因子IL．2培养液培养。待出现细胞大量增殖后收获细胞，MHC．AFPl58．166肽五聚体检测AFPl58．166特异性T细胞，细胞毒性实验检测其对靶细胞的特异性杀伤能力。结果：(1)28例肝细胞肝癌患者中，筛选出基因型HLA．A0201阳性者18例，2ml外周血可分离PBMC约lxl07个，未能检测出CD8+五聚体+T细胞。(2)T2细胞与AFPl58-166共同孵育，细胞表面HLA．A2分子表达增加，随着肽浓

6、度增加，HLA．A2平均荧光强度及表达率逐渐增加，在抗原肽浓度为451．tg／ml与60I．tg／ml时达到最大结合效力，90pg／ml时HLA-A2分子的表达下降。l0例健康志愿者，基因型HLA．A0201阳性者3例，每20ml外周血培养的细胞中可收获DC细胞(1．94+0．79)×106个，培养至第7天检测表面抗原：CD83、CD80、CD86和HLA．DR阳性率分别为(62．6+4．2)％、(90．4士2．4)％、(98．2土0．3)％和(87．9-4-4．2)％。(3)DC负载AFP】58．166与淋巴细胞混合培养14

7、d左右出现大量细胞增殖，流式检测CD8+MHC．AFPl58-166五聚体+细胞7．5％，与负载AFPl58．166的T2细胞混合培养的淋巴细胞中，未检测到CD8+MHC．AFPl58-166五聚体+细胞。天津医科大学硕士学位论文(3)细胞毒性实验显示，DC激活的淋巴细胞对AFP+肝癌细胞HepG2和负载AFP的T2细胞的杀伤率显著高于对未负载AFP的T2细胞和负载Her2抗原肽的T2细胞的杀伤率，差异具有统计学意义(萨0．05)(效靶比20：1时分别为45．12土10．60％和39．06士6．48％VS14．83士9．82％

8、和2．51士0．14％)；T2激活的淋巴细胞依效靶比20：1对上述细胞杀伤率分别为：HepG2(14．03士11．17)％，负载AFP的T2(8．49-a：7．34)％，T2(3．26：1：0．32)％，负载Her2的T2(3．36-a：2．45)％，与DC激活的淋巴细胞对H