干细胞体外诱导为类毛细胞的实验研究

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1、郑州大学2006届博士论文干细胞体外诱导为类毛细胞的实验研究千细胞体外诱导为类毛细胞的实验研究博士生王英导师董明敏郑州大学第一附属医院耳鼻咽喉科河南郑州450052摘要第一部分神经干细胞的分离培养、鉴定及标记目的神经干细胞(Nsc)的研究已逐渐成为国内、外基础及临床医学各专业的重要研究课题。Nsc是一种成体干细胞，存在于胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统的多个区域，属多能干细胞，在一定的微环境中具有自我更新和向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的能力，且具有极强的可塑性，利用NSC进行细胞治疗或基因治疗有很好的临床应用前景。豚鼠在耳科学基础研究中具有独特的优势

2、，并得到广大耳科学研究者的广泛应用，建立一种简便、可行的豚鼠Nsc培养方法将为Nsc在耳科学领域研究的深入开展提供细胞支持，但目前关于豚鼠Nsc的培养方法介绍的并不多。本实验旨在建立一种较为简便、可靠的豚鼠Nsc分离、培养、标记方法，为耳科学领域NSc的进一步深入研究提供帮助。材料与方法分离新生豚鼠海马组织进行Nsc的原代、传代培养及诱导分化培养，倒置显微镜下观察培养细胞的形态特征，培养的细胞行Nestin免疫细胞化学，wjstemBlot检测，对诱导细胞行NSE、GFAP免疫荧光化学观察，以鉴定所培养的细胞为Nsc；用荧光染料nAPI标记干细胞，计算原代及传

3、代标记率。结果1．原代培养见细胞呈大小不一、悬浮生长的细胞团，边界清晰，细胞团中细胞排列较为致密。光镜下传代培养的细胞形态特点与原代培养无明显差异。2．原代及传代培养的细胞团Nestin阳性表达，诱导分化后的细胞NsE、GFAP阳性表达。3．经荧光染料DAPI标记后，标记成功率可达93．4％，经传代8次后荧郑州大学z006届博士论文干细胞体外诱导为类毛细胞的实验研究光标记可传入子代细胞，其荧光亮度无明显衰减。结论1．本研究从新生豚鼠海马组织中分离、培养的细胞为NsCs。2．DAPI标记活细胞具有对细胞损伤小，标记效率高，可长期观察的优点。关键词豚鼠；神经干细胞

4、；细胞培养；细胞标记第二部分人工外淋巴液诱导神经干细胞的分化目的传统认为，成人组织中的干细胞只能定向分化为其所在组织类型的成熟细胞，但是，最近的一些研究结果显示，即使干细胞已经专门化，在某些条件下，成体干细胞仍具有多向分化潜能，甚至可以打破胚层界限，横向分化为无关类型的成熟细胞。体内试验研究表明神经干细胞移植内耳可在体内具有转化成毛细胞的能力；与此同时，KoiilIla等将神经干细胞体外培养，同样获得带有毛细胞特殊的标记蛋白的毛细胞免疫表型。目前已知，神经于细胞的分化受内在的遗传信息和外在的多种因素调控，如何选择最佳的外来因素是将神经干细胞诱导分化为毛细胞的关

5、键。本研究使用不同浓度的人工外淋巴液体外模拟内耳微环境诱导神经于细胞分化，以期为进一步研究和使用神经干细胞移植内耳奠定基础。材料与方法将原代培养的新生豚鼠海马来源的神经干细胞进行体外培养，诱导分化的神经干细胞分成4组：10％胎牛血清组，5％人工外淋巴液组，10％人工外淋巴液组，15％人工外淋巴液组；每组又分别分为2组：鼠尾胶原组，多聚赖氨酸组。用免疫荧光化学，w÷stcmBlot，扫描电镜对分化的细胞进行鉴定并观察不同生长基质对神经干细胞分化为类毛细胞的影响。结果1-胎牛血清及人工外淋巴液均能诱导分化神经干细胞为类毛细胞，细胞体积较小，以呈圆形、椭圆形及梨形为

6、主，无明显突起。2．10％胎牛血清组与15％人工外淋巴液组MyosjnⅦa阳性细胞约占12．8．13．6％，但10％人工外淋巴液组，5％人工外淋巴液组MyosinⅦa阳性细胞仅约占11．4％和3．9％(P<0．05)。3．wistemBlot结果提示细胞表达MyosinⅦa阳性。4．扫描电镜结果提示细胞呈圆形，亦有椭圆形，梨形，无明显突起。5．同样在15％人工外淋巴液中培养，多聚赖氨酸组与鼠尾胶原组间MyosinⅦa阳性细胞比较有明显统计学意义(P<0．05)。II郑州大学2006届博士论文干细胞体外诱导为类毛细胞的实验研究结论1-神经干细胞在胎牛血清和人工外

7、淋巴液中均可以存活并分化出表达毛细胞特异抗体的细胞。2．鼠尾胶原有利于神经干细胞向类毛细胞分化。关键词神经于细胞；毛细胞；分化；人工外淋巴液；鼠尾胶原×第三部分不同配方生长因子对神经干细胞分化为类毛细胞的影响目的神经干细胞移植内耳并有转化为毛细胞的能力，然而因毛细胞标记物阳性的细胞数量太少而功能恢复不佳。神经干细胞的分化受多种因素的影响，包括细胞与细胞、细胞与细胞基质之间的相互作用，以及细胞所处微环境中细胞因子、激素等多种小分子物质的作用。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)及脑衍生神经营养因子(BDNF)等生长因子在神经干细胞诱导分化及

8、内耳毛细胞再生上均起着不可或缺的作用。