cdmp诱导大鼠脂肪干细胞体外成软骨细胞的实验研究

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1、CDMP1诱导大鼠脂肪干细胞体外成软骨细胞的实验研究【摘要】 目的：应用软骨形态发生蛋白体外诱导SD大鼠脂肪干细胞向软骨方向分化，探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可行性以及CDMP1诱导的最佳剂量.方法：无菌取8只SD大鼠腹股沟脂肪组织，脂肪干细胞体外培养至第二代，以1×104/孔密度接种于24孔培养板里，12h后加入诱导液，分ABCD四组，以D组为阴性对照组.诱导14d，倒置显微镜观察细胞形态的变化，MTT法测定CDMP1对其增殖分化能力的影响，晡行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫熹组化染色.结果：诱导后可

2、χ见脂肪干细胞形态由长梭型驷明显向软骨细胞的多角形方颂向转变.MTT法测定CD晏MP1对脂肪干细胞的增殖能力提高，其中以C组为最鳔，但ABC三组之间两两比姘较无统计学意义，故提示C昼DMP1诱导的最佳浓度约７为50μg/L.甲苯胺蓝鳊染色法示糖胺聚糖均匀分布骣于基质中，免疫组化示诱导榻组Ⅱ型胶原表达阳性，对照铖组未见阳性表达.结论：C景DMP1诱导大鼠脂肪干细ぺ胞可以分泌软骨特异性基质肿糖胺聚糖和Ⅱ型胶原，并使坎其向软骨方向增殖分化，以50μg/L为CDMP1烤诱导的最佳浓度，并有望成为软骨组

3、织工程种子细胞的蟹新来源的方法之一.【关笄键词】 软骨形态，发生蛋酎白；脂肪干细胞；软骨细胞阏；胶原Ⅱ型9/9 0引言创饱伤、骨性关节炎(OA)以﹄及关节软骨病都能造成软骨柱组织损伤，严重影响患者的生活质量.而关节软骨的损公伤是不易修复的.由于软骨凡自发修复能力的局限性,轻四度关节软骨损伤会使损伤发易展甚至退变.关节软骨的退肷变是临床的挑战之一，它缺箜乏令人信服的治疗策略［1軎］.最近，组织工程作为一ⅸ种新方法的出现，它是联合笮种子细胞，支架和生物活性因子，建造功能性的新组织ц来代替损伤软骨.这

4、就使人篇们致力于理想的种子细胞，璜支架材料和生物活性因子的蓠的研究当中. Katayama等［2］用CDMP媳1基因转染兔骨髓基质干细头胞修复兔关节软骨缺损，在裰用CDMP1转染同源BMMC植入兔关节软骨缺损处腋8wk后，修复的软骨表面获形态可以与分化成熟的透明蛭软骨相比拟，而且软骨下组喾织也完全由接近宿主软骨下龊骨的新生厚层骨组织修复.椴这表明CDMP1能诱导骨蚱髓基质干细胞增殖分化成软槲骨细胞.Chang等［3］在小鼠皮下及肌肉内注射ΖCDMP1可诱导软骨组织师形成，提示CDMP1具有趟诱

5、导中胚层来源间质组织分酹化成软骨的能力.本实验我耘们利用CDMP1体外诱导肯SD大鼠脂肪干细胞向软骨细胞方向增殖分化，检测诱智导后细胞分泌软骨细胞特异詈性基质的能力，探索CDM壳P1诱导脂肪干细胞的合适荀剂量，为软骨组织工程提供免一种新的种子细胞来源方法.  1材料和方法9/9材纠料新生牛血清，高糖DME浏M，CDMP1，MTT，II型胶原单克隆抗体，即妖用型SABC试剂盒，倒置觚相差显微镜.7日龄SD仔鲶鼠8只，雌雄不限.方法珈的分离、原代培养和传代铕无菌条件下切取SD仔鼠腹景股沟的脂肪组织

6、，剔去细血管，DHanks液反炸复吹洗，剪碎脂肪组织，1000r/min离心8m鲸in，弃上清，加入1倍体积的10mg/L胶原酶Ⅰ蕻37℃消化60min,用⒕等体积的10mL/L新生储牛血清DMEM培养液中赡和，过200目筛网，90喽0r/min离心8min芴，弃上清，加10mL/L儒新生牛血清DMEM培养ю液，小心吹打约100次，邢分装接种于25cm2的培芝养瓶，置37℃50mL/凤LCO2的培养箱里孵育.略24h后首次换液，弃去未细贴壁的细胞.以后每2d换ε液1次，待细胞生长融合至

7、风80%时传代，用g/L胰パ蛋白酶37℃消化约5mi犰n,10mL/L新生牛血愉清DMEM培养液中和，钇900r/min离心8m赖in.最后以1×104/桐cm2密度接种于新的25士cm2培养瓶中，置37℃羁50mL/LCO2培养箱适中孵育，每隔2d换液1次螵.细胞爬片及成软骨细胞诱导取生长良好的第二代ADSCs细胞以1×103余个/孔的密度接种于2块2吲4孔的培养板里，孔底放置锔由多聚赖氨酸包被的盖玻片酒.每板分ABCD四组:对递照组加基础培养液培养，诱楮导组于细胞爬片12h后，9/9分别

8、加入相应的诱导液.每靓2d换液一次.37℃CO矿2箱里培养14d.法测玢定CDMP1对ADSCs谔增殖的影响取第2代ADS弯Cs细胞，以1×103个/孔密度接种于5块平底9恳6孔培养板里.每板分AB衾CD四组，对照组(D组)篚加基础培养液，诱导组加相应的诱导培养液.每隔1d检测1块，分析CDMP1倪对ADSCs的增殖能力的影响.Ⅱ型胶原免疫组织秒化学的检测细胞爬片第14峤d，取第一块24孔培养板ネ，取出盖玻片，950mL锴/L乙醇固定15min，稃PBS洗2遍