mir-375499在猪睾丸组织不同发育阶段表达研究及靶基因验证

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1、miR-375/499在猪睾丸组织不同发育阶段表达研究及靶基因验证DifferentialExpressionofmiR-375/499andValidationofPredictedTargetGenesintheTesticularTissueofSwineatDifferentDevelopmentalStages作者姓名：张晓军专业名称：动物遗传育种与繁殖指导教师：孙博兴副教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月3日中文摘要miR-375/499在猪睾丸组织不同发育阶段表达研究及靶基因验证MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源性非编码序列，广泛地存在

2、于多种组织和器官中，通过降解mRNA或阻碍其翻译的方式调节靶基因，从而实现对生命体重要的调控作用。有研究表明，miRNAs在睾丸组织中也有表达，并且对曲细精管的发育及精子成熟都有重要的调控作用。miR-375和miR-499是经过前人高通量测序鉴定出在军牧1号白猪1月龄睾丸组织和6月龄睾丸组织中存在差异表达的两个miRNAs，因此本研究针对miR-375和miR-499在1日龄，1-7月龄睾丸组织中的表达水平进行检测，并且对它们的靶基因进行验证。首先观察了1日龄，1-7月龄的军牧1号种公猪睾丸组织形态。结果表明，随月龄增大，睾丸组织中曲细精管管腔逐渐增大，同一视野下，曲细精

3、管数目逐渐减少，并且曲细精管管腔之间的结缔组织也逐渐减少，管腔中的支持细胞和精母细胞逐渐向基底膜靠近。与此同时，对不同月龄睾丸组织中生物信息学预测的miR-375可能的靶基因DIAPH2,YAP1,YBX1,ITPKB和NR5A2，miR-499可能的靶基因CYLC1,DMRT1,QKI,XRN2和ZNF313进行了实时荧光定量检测。结果表明，miR-375在1日龄，1-3月龄睾丸组织中表达量均较低，4月龄表达量有所增加，4-7月龄呈现显著上调趋势。miR-499在1日龄到2月龄表达量呈上调趋势，然后2-7月龄呈下调趋势，2月龄表达量最高，7月龄表达量最低。而miR-375

4、和miR-499的靶基因在不同发育阶段睾丸组织中均存在差异表达，并且经SPSS13.0分析可知，miR-375和靶基因DIAPH2存在显著负相关，miR-499和靶基因QKI存在显著负相关。然后对miR-499的靶基因QKI在不同月龄睾丸组织中蛋白水平的表达量分析。经蛋白免疫印迹研究表明，QKI基因在1日龄表达量比1-4月龄表达量高，1-4月龄表达量相对较低，但5-7月龄时表达量较高。结果可知，QKI基因在后期睾丸组织中表达量较高。然后利用双荧光素酶报告基因法验证miR-499及QKI的靶标关系，首先利用I3’RACE技术扩增了QKI基因的3’UTR区，然后构建了QKI基因

5、3’UTR的表达载体，干扰载体及空载体（pmiR-RB-REPORT-QKI-WT/si/mut）。将miR-499的模拟物及miRNA阴性对照与三种载体分别共转染后检测荧光值。结果显示，①阴性miRNA对QKI三种载体影响差异不大；②而miR-499对野生型QKI载体影响显著，显著低于miR-499和突变型及空载体组；③而突变型组及空载体组之间的荧光值差异不显著。说明，QKI基因的3’UTR区存在miR-499的靶位点。经以上实验初步验证后，构建miR-499的过表达载体转染猪睾丸细胞系后经荧光定量检测可知，①过表达的miR-499组相对于阴性对照组和空白组，miR-49

6、9的表达量显著高于阴性对照组及空白组，而空白组与阴性对照组无显著差异；②利用荧光定量检测靶基因的表达量显示，过表达miR-499组的QKI基因表达量显著少于空白组及阴性对照组中的QKI基因的表达量；③并且免疫印迹实验显示，过表达miR-499组QKI的蛋白表达量显著低于阴性对照组及空白组，而空白组与阴性对照组无显著差异。以上实验结果与睾丸组织发育切片结合，推测不同发育阶段的miR-375/499及其各自的靶基因的差异表达可能和睾丸组织发育程度有关。关键词：猪；睾丸组织；miR-375/499；DIAPH2；QKIIIAbstractDifferentialExpressio

7、nofmiR-375/499andValidationofPredictedTargetGenesintheTesticularTissueofSwineatDifferentDevelopmentalStagesMicroRNAs(miRNAs)areclassesofendogenoussmallnon-codingsequenceswhichwidelyexistedintissuesandorgans.AndmiRNAsplayimportantroleinmanyprocessesbytheirtarge