intl-iscr1-qnrb多重pcr方法的建立及临床应用

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1、学校代码10459学号或申请号201212443288密级公开硕士学位论文IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的建立及临床应用作者姓名：张凤岐导师姓名：沈燕教授学科门类：医学专业名称：临床检验诊断学培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2015年5月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheestablishmentofIntI-ISCR1-qnrBmultiplexPCRanditsclinicalapplicationByFengqiZhangSupervisor:Prof.YanShenClini

2、callaboratoryDiagnosticsTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2015原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研宄所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：曰期：w年广月曰学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或

3、向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年f月&日摘要IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的建立及临床应用硕士研究生：张凤岐导师：沈燕教授郑州大学第一附属医院河南郑州450052摘要喹诺酮类药物是目前应用非常广泛的广谱抗生素之一，细菌对该类药物的耐药性备受关注。介导喹诺酮类药物耐药的

4、机制包括染色体基因突变和质粒介导的喹诺酮耐药。其中，qnr基因是近年来的研究热点，qnr基因型包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrS，本地区以qnrB型多见。qnrB存在于ISCR1（InsertionSequenceCommonRegions1，插入序列共同区1)可变区内，与ISCR1相连介导耐药传播。而ISCR1通常与I类整合子结合，组成复合性I类整合子。由于同时含有I类整合子和ISCR1两种基因转移元件，因此，复合性I类整合子具有对耐药基因更强大的传播能力。对整合子、qnr基因等的检测，以往的方法主要有：PCR-RFLP、脉冲凝胶电泳技术、SouthernBlot技术等，这些方法

5、繁琐，耗时耗力，因此建立一种快速简便的检测IntI-ISCR1-qnrB的方法十分必要。鉴于此，本研究通过调查研究199例临床分离株，首先建立一种可快速检测I类整合子、ISCR1和喹诺酮耐药基因qnrB的IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评价。在此基础上，利用所建立的IntI-ISCR1-qnrB方法检测临床分离株，通过与药敏试验方法比较，分析方法的临床应用价值，为喹诺酮类耐药提供临床预警信息。方法1．菌株来源：199例革兰阴性杆菌菌株分离自2014年11月9日至2014年5月5日期间某院临床各科室送检标本。2．微生物鉴定和药敏系统对所有临床分离株

6、进行鉴定和药敏分析。I摘要3．采用PrimerPremier5.0软件，以I类整合酶基因、ISCR1保守区orf513、qnrB基因保守区为靶区分别设计特异性的引物，构建IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法反应体系。4．梯度PCR法确定IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的最适退火温度。5．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法同时检测I类整合子、ISCR1、qnrB耐药基因，琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，以ImageJ软件扫描电泳条带灰度值，对目的基因进行半定量分析。6．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法检测80例临床分离菌株，并对PCR产物进行测序，

7、评价建立的IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的特异性。87．麦氏比浊法检测细菌浓度，将细菌原始浓度稀释成10cfu/ml，并依次倍7654321比稀释为10、10、10、10、10、10、10cfu/ml，用IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法进行扩增,分析该方法的灵敏度。8．以IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法检测119例临床分离株，并与药敏试验结果比较。9．采用SPSS17.0软件进行数据