hsp65-peaⅰ融合蛋白表达纯化及免疫效果研究

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1、分类号：Q78单位代码：10193密级：公开公开学号：2012564硕士学位论文HSP65-PEAⅠ融合蛋白表达纯化及免疫效果研究Studyontheexpression,purificationandimmuneefficacyoffusionproteinHSP65‐PEAⅠ作者姓名：何苗学位类别：工学硕士专业名称：食品科学研究方向：食品微生物与生物技术指导教师：陈萍教授所在学院：食品科学与工程学院二零一五年六月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经

2、发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位

3、论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要绿脓杆菌是极受关注的条件致病菌，在食品中毒素残留引起的食物中毒事件越来越多，其具有多重耐药性，免疫预防绿脓杆菌中毒成为了研究的热点。同时，绿脓杆菌也是烧烫伤表面感染的主要致病菌。其主要致病因子为绿脓杆菌外毒素A（PEA），PEA通过受体

4、结合亚基与细胞表面受体相结合，毒性部分越膜亚基运输到细胞内，催化EF-2的核糖基化抑制蛋白合成使靶细胞死亡。热休克蛋白65（HSP65）是主要的分子伴侣家族之一，参与蛋白质的折叠，防止蛋白变性聚集，促进变性蛋白解聚进行重折叠，维护细胞结构与功能。本研究采用基因工程手段，将PEA受体结合亚基（PEAⅠ）与热休克蛋白65进行融合表达，研制一种抗绿脓杆菌毒素侵袭的有效疫苗。该疫苗不仅具有PEA的高度保守性和免疫原性，还具有热休克蛋白增强免疫的特点。进一步为防治食源性绿脓杆菌感染、抗烧烫伤病人多器官衰竭的研究奠定了基础。利用基因工程手段将HSP65-PEAⅠ基因片段经HindⅢ和No

5、tⅠ双酶切后连接到pET-28a载体中，构建重组表达质粒pET-28a-HHP，导入感受态E.coliBL21（DE3）细胞，获得表达菌E.coliBL21（DE3）（pET-28a-HHP），经诱导表达重组蛋白HHP，摸索纯化工艺获得最佳纯化条件，最终得到纯度为90%的HHP纯品。以HHP为免疫原，建立小鼠免疫试验模型，检测抗体效价水平，初步评价免疫效果。优化并确定最佳免疫程序，为建立烧烫伤感染多器官衰竭动物模型免疫保护实验奠定基础。重组表达质粒pET-28a-HHP，经PCR和双酶切鉴定正确后，测序结果显示：基因片段HSP65-PEAⅠ正确克隆到pET-28a载体中，表达

6、的重组蛋白相对分子质量约为97000Da，以包涵体形式表达，对包涵体洗涤、变性以及复性工艺进行优化后，最佳的条件为：2%TritonX-100和2MUrea依次洗涤，8MUrea变性裂解，逐步透析至尿素的终浓度为0.5M完成复性。可溶形式蛋白HHP进一步纯化工艺为：样品经Q阴离子交换层析---SephadexTMG-25Fine层析---金属螯合层析（Cu2+），获得浓度为0.5mg/mL，纯度达90%以上的HHP。在用HHP蛋白对小鼠免疫的一周后检测到特异性抗体，抗体效价水平持续增长且在42天均达到了1:210以上，其中铝盐佐剂组产生的抗体滴度最高。免疫动物攻毒保护实验结果

7、显示：铝盐佐剂组攻毒保护率最高，对3×LD50剂量毒素保护率高达100%，对5×LD50剂量毒素保护率为80%。最终确定最佳免疫程序为：免疫制剂为20μgHHP蛋白与铝盐佐剂1:1(v:v)混合，免疫的第49d抗体滴度达到1:212，对实验鼠进行PEA攻毒，能够耐受3×LD50攻毒剂量，对5×LD50攻毒保护率高于80%。在本研究中，成功改造后的重组表达质粒pET-28a-HHP在大肠杆菌中高效表达蛋白IHHP，具有组氨酸标签，纯化工艺流程简单，耗时短，纯度高，适用于中试规模进行生产。制备的抗PEA免疫