etec k88细胞适配体的筛选和快速检测研究

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1、硕士学位论文ETECK88细胞适配体的筛选和快速检测研究学科专业生物学·微生物学学位类型科学学位□专业学位研究生姓名凌敏导师姓名、职称邓乐教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月分类号密级学校代码10542学号201202141177ETECK88细胞适配体的筛选和快速检测研究Theselectionandrapiddetectionresearchofcell-aptameragainstETECK88研究生姓名凌敏指导教师姓名、职称邓乐教授学科专业生物学·微生物学研究方向现代微生物技术湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑

2、重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中臣经注明引用的巧容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作爲成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承捏。学位论文作者签杂年巧ｋ巧參入七湖南师范大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部口或机拘送交论文的复巧件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可私将本学

3、位论文货全部或部分巧容编入有关数据库进行检索，可Ｌ乂采用影巧、缩巧或爸描等复制手段保存和汇编本学位论文。作者签名：凌龄日期皮年＾片导师签名：呵导曰期：豕／篇＾足／；摘要大肠杆菌（E.coli）引起的腹泻在世界范围内成为了一个主要的公共卫生问题。其中产肠毒素大肠杆菌K88（EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETECK88）是一种最常见的引起腹泻的致病菌。它易于通过食物摄取进入体内，极易使新生儿和断奶仔猪的胃肠道发生感染。因此，建立一种新的快速灵敏检测ETECK88的方法是非常必要的。适配体（Aptamer）是ssDNA或者RNA，可以与靶标

4、进行高亲和力和高特异性的结合。目前适配体常用的筛选手段为指数级富集配体的系统进化技术（SELEX）。其靶标包括金属离子、有机小分子、药物、甚至单分子蛋白质和细胞。与传统的抗体相比，它具有廉价、易合成和可修饰的优点，被广泛的应用于分子检测、诊断治疗和生物标记物发现等领域。石墨烯具有独特的平面结构和优良的导电、导热性。氧化石墨烯（GO）是一种富氧基团（C/O≈2）的石墨烯，与石墨烯相比它极大的增强了亲和性及水溶性。同时，作为一种高效的荧光淬灭剂，它能够淬灭荧光体（上转换纳米材料、量子点及染料分子）的荧光，能稳定的吸附ssDNA。近年来，利用GO优良的特性，相继开发了各种纳米生物传感器。本论文以ET

5、ECK88为目标细菌，通过SELEX方法筛选出细胞适配体，并测定适配体与靶标之间的亲和力和特异性；构建了以细胞I适配体为特异性探针，以GO为荧光淬灭剂的纳米生物传感器用于ETECK88的快速检测。具体实验结果如下：一、采用CELL-SELEX技术，通过11轮正筛选和4轮反筛选，获得了一组富集度高、特异性强的适配体序列。经纯化和克隆，得到37个阳性克隆子。测序后进行一级同源性比对和二级结构分析，可将它们分成三个家族。其中适配体A04的亲和力最高（Kd=28nmol）。后续实验表明，ETECK88与适配体A04的结合具有高特异性和灵敏性。二、利用GO纳米荧光淬灭剂的特性以及Klenowfragme

6、nt（KF）-辅助靶标循环放大的功能，构建了一种新型的纳米传感器用于ETECK88的快速检测。该传感器包括捕获探针和信号探针。靶标加入前两个探针形成了部分双链结构（PDSJ）并且吸附在石墨烯上，此时荧光淬灭。当加入靶标后，靶标与PDSJ形成了复合物，从而使PDSJ从GO上释放出来，荧光得以恢复。随后KF的加入引发了PDSJ的聚合反应，从而置换出靶标，置换出来的靶标能够与其它的PDSJ结合，进入下一轮循环。靶标的循环利用使更多的PDSJ得以释放，检28测的荧光信号显著加强。实验结果表明，在菌体浓度10~10-1CFU·mL范围内，该传感器具有高特异性和灵敏性，线性关系良好，22-1相关系数R=0

7、.9907。其检测下限达到了10CFU·mL，比其他方法低10倍。关键词：适配体筛选，ETECK88检测，氧化石墨烯，KlenowfragmentIIABSTRACTDiarrheacausedbyE.colihasbeenformedamajorpublichealthproblemintheworld.EnterotoxigenicEscherichiacoli(ETECK88)isoneof