脊髓缺血再灌注损伤大鼠mirna表达谱的筛选与初步分析

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1、脊髓缺血再灌注损伤大鼠miRNA表达谱的筛选与初步分析ScreeningandpreliminaryanalysisofmiRNAsexpressionprofileinratduringspinalcordischemia-reperfusioninjury作者姓名：刘志刚专业名称：外科学研究方向：脊柱外科指导教师：杨小玉教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学中日联谊医院论文答辩日期：2015年06月01日授予学位日期：论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位毕郑刚教授哈尔滨医科大

2、学附属第一医院主席张学文教授吉林大学中日联谊医院郭宗泽教授中国医科大学附属第一医院委员姜金兰教授吉林大学中日联谊医院牟冬梅教授吉林大学公共卫生学院高忠礼教授吉林大学中日联谊医院朱筱娟教授东北师范大学生命科学院鲍永利教授东北师范大学生命科学院郭庆升教授辽宁省人民医院章培标教授中科院长春应用化学研究所中文摘要脊髓缺血再灌注损伤大鼠miRNA表达谱的筛选与初步分析脊髓损伤是一种很难治愈、后果严重的中枢神经系统损伤。学者们对脊髓损伤的病因及机制进行了大量的临床与基础研究。人们发现，除原发性脊髓损伤外，原发性脊髓损

3、伤之后的继发性损害，如脊髓缺血再灌注损伤（spinalcordischemia-reperfusioninjury，SCIRI）同样是造成脊髓神经系统损伤的一个重要因素。然而，针对于脊髓缺血再灌注损伤目前尚缺乏有效、公认的治疗药物和治疗手段。鉴于此，揭示脊髓缺血再灌注损伤的病理分子机制迫在眉睫。microRNA（miRNA）是由18~24个核苷酸分子组成的短链非编码RNA分子，miRNA是一类具有强大功能的代谢调节分子，可以特异性抑制mRNA的翻译过程，进而在转录后水平调节基因的表达。最近的研究表明，mi

4、RNA存在于包括脑、脊髓在内的哺乳动物中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）中，而且在中枢神经系统损伤、损伤修复以及变性疾病的病理生理进程中起到了重要的调节作用。但是，miRNA在缺血再灌注损伤的受损脊髓组织中的调节模式目前尚不明确，探究miRNA在脊髓缺血再灌注损伤病理生理进程以及损伤修复过程中的调控模式，对推动脊髓缺血再灌注损伤治疗手段的进步以及针对脊髓缺血再灌注损伤的特效药物研发具有重大意义。因此，本研究中我们构建了脊髓缺血再灌注大鼠模型，并利用Qiagen公司的miRCU

5、RYTMLNAArray(v.16.0)miRNA芯片分别检测脊髓单纯缺血损伤、脊髓缺血再灌注损伤后大鼠脊髓组织中的miRNA表达谱，建立差异表达miRNA谱（大于1.5倍）。并在利用实时定量PCR实验方法在脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠脊髓组织中验证miRNA芯片中得到特殊差异表达miRNA。随后利用microRNA.org、Microcosm、miRBase数据库对差异表达倍数大于5倍的差异表达miRNA的靶基因进行预测，并对预测的靶基因进行基因本体论（GO）以及pathway富集分析；同时在TRED数据

6、库中提取靶基因中的转录因子信息，利用Cytoscapevesion3.2.0软件绘制了miRNAs-TFs-Genes调控网络图，初步分析这I些高差异倍数miRNA所调控的生物学功能。研究目的基于大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，高通量筛选基于大鼠脊髓缺血再灌注损伤区域组织中异常表达的miRNA，并通过以这些异常表达miRNA为核心构建分子调控网络，旨在从整体角度对大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型中miRNA的调控模式进行初步探讨。研究方法一、大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型构建通过阻断成熟SD大鼠的腹主动脉构建脊髓缺血再

7、灌注损伤大鼠模型，将24只SD大鼠分为：假手术组、单纯脊髓缺血组、脊髓缺血再灌注24小时组以及脊髓缺血再灌注48小时组。利用BassoBeattieBresnahan（BBB）评分系统对脊髓缺血再灌注后大鼠的运动神经功能进行评价。利用Hematoxylin-Eosin（HE）染色实验方法检测脊髓缺血再灌注损伤后脊髓神经细胞形态的变化情况。并统计分析，确定大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型成功构建。二、脊髓缺血再灌注损伤大鼠miRNA表达谱筛选提取大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型中脊髓组织总RNA，利用miRCURYTM

8、LNAArray(v.16.0)miRNA芯片分别检测单纯脊髓缺血组、脊髓缺血再灌注24小时组以及脊髓缺血再灌注48小时组差异表达miRNA谱，利用实时定量PCR实验验证miRNA芯片的表达数据。利用非监督性层次聚类方法分析差异表达miRNA信息。三、脊髓缺血再灌注损伤大鼠miRNA调控模式初步分析合并脊髓缺血再灌注24小时组和脊髓缺血再灌注48小时组的差异表达miRNA数据作为脊髓缺血再灌注损伤整体差异表达miRNA模式，选