结直肠癌标志性microrna分子的筛选及其功能研究

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1、前言结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，每年全球范围内新增病例约100万例，即使在发达国家，其致死率也已达到33%，在发展中国家则尤为严重。其临床表现为直肠出血、贫血等，并伴随体重下降、肠道功能异常等现象。常常是由生活习惯或年龄增长引起肠道细胞过度增殖所致。位于肠壁内的原发性结直肠癌多数可通过肠镜等简单的检测手段查出，手术和化疗往往能够收到比较好的治疗效果，若一旦出现转移，则很可能导致患者死亡。因此，早期检查和治疗是有效降低结直肠癌致死率的关键。目前临床普遍采用的检测手段仍是以病理组织染色为基础的肿瘤分级分期系

2、统，虽然可以大体上推定病程及治疗方案，但无法确定患者个体所属的肿瘤亚型，很难给出精确的病情判断和手术、化疗方案，个体化治疗更是无从谈起。可能造成患者接受常规治疗后，不但无法达到预期效果，还要背负沉重的经济负担。因此，开发更为精准的诊断手段，尤其是预测不同个体对常规疗法的应答水平差异，按患者类型制定合理有效的治疗方案，已刻不容缓。目前国际上通常采用常规病理组织染色辅以分子标志物检测来提高检测精确度，细化诊断类型。分子标志物是肿瘤细胞的名片，通常是在某种类型的肿瘤组织中表达异常，且与该肿瘤的发生发展、临床诊断及

3、预后密切相关的一类分子。结直肠癌的候选蛋白类分子标志物包括KRAS、APC、β-catenin和TP53等，许多研究表明它们表达水平的变化或突变类型的出现与肿瘤细胞的恶性演变相关，可用以辅助临床诊断，但患者间较大的个体差异性使得蛋白质类分子标志物的推广应用受阻。另一类标志是肿瘤细胞的核型，结直肠癌细胞核型经常出现特异性的染色体组不稳定或微卫星不稳定等情况，这些核型变化的出现往往直接关系到化疗药物的疗效，可以说具有很强的临床指导意义。但与蛋白质类分子标志物相似，无法避免的个体差异性和相对复杂的检测手段是制约其

4、发展的重要因素。microRNA是近年来兴起的研究领域，已有很多研究发现，多种miRNA与肿瘤的发生发展具有千丝万缕的联系。而miRNA的表达水平在不同患者个体间的差异较小。临床上可采用构建多种miRNA检测网络的策略，进一步缩小个体差异，提高精确度。另外，其检测方法本身具有的简单易行等优点，使其具有良好的应用前景。本课题就是通过芯片筛选结直肠癌组织与正常组织间的miRNA表达差异，选取具有较高肿瘤特异性的分子，进一步研究其与结直肠癌病理进程的相关性，及其在肿瘤发生发展中的生物学功能。讨论将miRNA纳入结

5、直肠癌临床检测指标的可行性，使理论研究更好的服务于临床实践。中文摘要结直肠癌标志性microRNA分子的筛选及其功能研究背景：结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，每年全世界范围内的新增病例超过100万例，位于肠壁内的原发性结直肠癌采用手术和化疗往往能够收到比较好的治疗效果，5年生存率约为90%，即使在发达国家，结直肠癌的总体致死率仍有33%之多。尽管癌组织周边淋巴结未检测到明显转移灶，其复发率也可达25%，绝大多数死亡的结直肠癌病例均是由于出现远端转移，因此，早期检查和治疗是有效降低结直肠癌致死率的关键。目前的

6、临床检测方法主要是病理组织染色，为提高诊断准确性，尤其是预测患者对常规疗法的应答水平，更好地指导诊断和用药，往往辅以分子标志物的检测。采用分子标志物作为结直肠癌诊断和预后指标具有很多优越性，但潜在的标志蛋白质分子多涉及癌症的各种增殖或凋亡信号通路，通常存在诸多突变型，增加了检测的困难程度和结果的不确定性。另外，较大的个体差异也是其推广应用的一大阻碍。核型分析也存在类似的问题，检测手段繁琐，个体重复性差，使得这些检测方法只能作为常规病理检测手段的辅助选项，对于临床诊断和疗效预测贡献极小。miRNA直到近些年才

7、被纳入分子标志物的选择范畴，它具有检测方便、成本低廉、灵敏度高等优点。本课题的目的就是在于筛选并获得结直肠癌特异性miRNA分子，并详细阐述其生物学功能与临床意义。方法：首先采用miRNA检测芯片分析5例结直肠癌组织和癌旁正常组织的miRNA表达谱，对比筛选差异基因。再扩大样本量至30例，用Realtime-PCR验证筛选结果，分析其表达水平与结直肠癌分级分期的相关性，同时检测结直肠癌细胞系和正常结肠细胞该miRNA的表达差异。确定差异显著的miRNA后，在结直肠癌细胞系中通过质粒过表达和消减表达的实验，研

8、究该miRNA的生物学功能。随后采用软件分析其序列并预测目的基因，以荧光素酶报告基因系统和定量PCR、免疫印迹等方法进行验证，并在结直肠癌细胞系中研究miRNA及其调控靶基因对细胞增殖、周期和侵袭能力的调控作用。最后，在小鼠移植瘤模型中验证体外实验结果，通过对比瘤重、肿瘤体积等数据，确定该ImiRNA对在体肿瘤组织生长的影响。结果：芯片检测结果发现，与相应的癌旁对照组织相比较，miR-103在结直肠癌组织中高表达