microrna-133b在结直肠癌细胞系中靶基因的筛选

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1、中图分类号＆鱼§鱼：坌UDC61O博士学位论文学校代码!Q墨兰圣密级公珏MicroRNA-I33b在结直肠癌细胞系中靶基因的筛选ScreeningtheTargetGeneofMicroRNA—·13binColorectalCancerCellLines作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：杜鹃临床医学外科学湘雅三医院李小荣教授答辩委员会主席f鱼这中南大学2013年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表

2、或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：塌学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：监即签名筚嗍』年』鱼日MicroR

3、NA-133b在结直肠癌细胞系中靶基因的筛选摘要：研究背景：结直肠癌(Colorectalcarcinoma，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一，全球CRC的发病率均呈上升趋势。CRC的发生发展过程与众多肿瘤相关因子的异常表达及功能改变有关。miRNA是一类内源性的非编码单链RNA，由22个左右核苷酸组成，其靶向抑制mRNA的翻译或直接将其降解，使靶基因在转录后水平的表达受到抑制，从而起到基因表达的调控作用n1。2003年，Michael等瞳1最早报道了miRNA在人结直肠癌组织和正常结直肠黏膜中的差异表达，检测到28种miRNAs表达发生了变化

4、，其中miR-143和miR-145在癌组织中表达较正常组织明显降低。随后的研究发现众多miRNA参与了CRC的发生发展过程，并与CRC的诊断、分期、治疗与预后等密切相关口’41。miRNA通过调控不同的靶基因在肿瘤中起到类似于原癌基因或抑癌基因的作用瞄1。miR-133b最初被认为是一种心肌特异性的miRNA，在心肌的发育和功能维持方面起重要作用m’7

5、。近年有研究小组几乎同时发现miR-133b在肺癌随3、食道癌阳1、舌癌n0l、胃癌nll、膀胱癌n羽等不同肿瘤中表达失调，并具有明确的肿瘤抑制效应。胡桂等n3’141首次通过研究证实了miR-

6、133b在结直肠癌组织及细胞系中的表达明显下调，且与结直肠癌细胞的恶性程度密切相关；功能实验进一步证实miR-133b可抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移，并具有明显的细胞周期阻滞的作用；动物实验发现在裸鼠体内同样有明确的肿瘤抑制作用。尽管如此，miR-133b在CRC中的作用机制仍不明确，需进行进一步研究。研究目的：本实验在前期实验的基础上，通过细胞转染建立miR-133b高表达的结直肠癌细胞系，并与未转染的结直肠癌细胞对比进行基因芯片高通量测序及基因的功能注释，筛选出miR-133b在CRC中可能相关的靶基因。材料与方法：本研究选用两种购自ATCC

7、细胞库的结直肠癌细胞系SW620及HT29，将细胞分成4组进行细胞转染。实验分组为miR-133bmimics转染组(用Lipofectamine2000即Lip02000转染miR-133bmimics)，NC转染组(用Lip02000转染miRnegativecontr01)，空白组(Blank，加入与前2组等量的Lip02000，无miRNA片段)，对照组(Control，细胞常规培养，不加入Lip02000和miRNA片段)。将转染后细胞进行倒置荧光显微镜下的荧光显色情况观察，并采用real．timePCR的方式检测各组细胞中miR-13

8、3b的表达情况，评价其转染效率。将成功转染了miR-133bmimics的两种细胞分别与相应细胞的NC转染组配对进行Agilent人全基因表达谱芯片的高通量测序。检测出的差异基因初步根据基因在miR-133b组中表达下调、尸

9、620及HT29的最佳浓度为80nM，转染效率可达50％左右。通过Real．timePCR法检测miR-133bmimics转染组，NC