红花黄酮醇合成酶基因表达载体的构建、遗传转化及功能研究

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1、分类号：Q786单位代码：10193密级：公开学号：2012069硕士学位论文红花黄酮醇合成酶基因表达载体的构建、遗传转化及功能研究Constructionofexpressionvector、genetictransformationandfunctionalanalysisofflavonolsynthasegeneinCarthamustinctoriusL.作者姓名：杨文婷学位类别：农学硕士专业名称：作物生物技术研究方向：生物反应器与代谢工程指导教师：李校堃教授所在学院：生命科学学院2015年5月独创性声明本

2、人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校

3、攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日

4、指导教师签名：签字日期：年月日吉林农业大学硕士学位论文摘要摘要红花为菊科，一年生的草本植物，干燥的管状花，具有活血、通经、散瘀、止痛等疗效。黄酮类化合物是红花中的主要有效成分之一，目前在基因水平的研究中，黄酮化合物代谢途径是最为清楚的植物次生代谢途径之一。黄酮醇合酶（flavonolsynthase，FLS）是黄酮化合物代谢途径中的关键酶之一，在植物发育过程中起着关键作用。本研究在获得红花黄酮醇合酶基因全长cDNA序列的基础上，对吉红早熟红花的盛花期花瓣中的黄酮醇合酶基因进行亚克隆；构建红花黄酮醇合酶基因的植物表达载

5、体，转化拟南芥并对转基因拟南芥阳性植株进行黄酮含量分析，同时，构建红花黄酮醇合酶基因的原核表达载体，使目的基因在大肠杆菌中表达出特异性蛋白。本研究为进一步探明黄酮醇合酶基因的功能及该基因在黄酮化合物合成途径中的作用奠定了基础。主要研究结果如下：1)根据已知的黄酮醇合酶基因全长cDNA序列，设计全长特异性引物，以提取吉红早熟红花的盛花期花瓣总RNA，反转录成的cDNA为模版，克隆红花FLS基因。经测序分析，所克隆的黄酮醇合酶基因序列与已知序列一致，全长为1201bp。2)利用DNA重组法，成功构建pBasta-FLS植

6、物表达载体，并转入根癌农杆菌EHA105中，利用FloralDip法侵染拟南芥。对所获得的28株抗性植株进行PCR检测，PCR结果显示，其中20株为阳性植株，说明目的基因已经转入拟南芥中。3)对T3代转基因拟南芥植株进行黄酮含量测定，结果表明，转红花FLS基因的拟南芥中的黄酮含量比野生型拟南芥中的黄酮含量均有所提高，最高提高2.2倍，说明红花FLS基因能够有效调控黄酮化合物的合成。4)将红花FLS基因与pET28a（+）载体分别进行双酶切后连接，构建了pET28a-FLS原核表达载体，获得了44kD大小的蛋白,说明该

7、基因能够在大肠杆菌中成功表达，为后续对该基因的活性研究奠定基础。关键词：红花；黄酮醇合成酶；表达载体构建；原核表达I吉林农业大学硕士学位论文AbstractAbstractCarthamustinctoriusL.isadrytubularfloretannualherb.Itisusedmainlyforinvigoratingthecirculationofmenstruation,promotingbloodcirculation,reducingpainandmanykindsofpharmacologica

8、laction.FlavonoidisoneofthemaineffectivecomponentsinSafflower,flavonoidsmetabolicpathwayhasbeenresearchedclearlyinthegeneticlevel.Flavonolsynthase(FLS)isoneofthekeyenzymesin