大肠杆菌k-12转醛醇酶基因的克隆及在运动发酵单胞菌cp4中的表达

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1、天津大学硕士学位论文大肠杆菌K-12转醛醇酶基因的克隆及在运动发酵单胞菌CP4中的表达姓名：管于平申请学位级别：硕士专业：化学工程指导教师：刘成20050101中文摘要运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)属于革兰氏阴性细菌，微好氧生长。它对糖的摄取速度和发酵生成乙醇的速度均优于传统酿酒酵母，但其可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖。对ZmobilisCP4进行基因工程改造，使其能代谢木糖生产乙醇，是本中心的一个大课题，本工作是其中～部分，即克隆E．coliK．12talB，并使其在Z．mobilisCP4中表达。首先从

2、E．coliK-12克隆了ta／B基因，并利用PCR重叠延伸技术将E．coliK-12ta／B基因自身的启动子换成Z．mobilisCP4eno的启动子，得到Peno—talB基因，分别与穿梭载体pZBl连接，得到质粒pZ,B1-talB、pZBl一Peno—talB。测定了转化子E．coliDH5ct(pZBl．talB)和E．coliDH5a(pZBl-Peno—talB)无细胞粗提液中转醛醇酶的酶活。结果表明，两个转化予的酶活水平相当，分别为0．106、0．109U／mg蛋白，均比对照菌抹E．coliDH50t(pZBl)的

3、酶活高一倍左右(为0．05U／mg蛋白)。将pZBl一ta／13和pZBl．Peno—talB分别转化ZmobilisCP4，并测定了不同培养时间转化子无细胞粗提液中转醛醇酶的酶活。结果如下：Z．mobilisCP4(pZBl-talB)在培养16h、20h和24h时的转醛醇酶酶活分别为0．038、O．054、O．059U／mg蛋白；ZmobilisCP4(pZBl-Peno—talB)的转醛醇酶酶活分别为0．03、O．038、0．051U／mg蛋白；野生型的Z．mobilisCP4没有检测到转醛醇酶酶活。表明从对数后期到稳定期，

4、talB和Peno—talB在Z．mobilisCP4中的表达水平是逐渐增加的：且talB基因自身启动子能被Z．mobilisCP4很好识别并启动转录。对Z’mobilisCP4(pZBl)、Z．mobilisCP4(pZBl-Peno—talB)的生长情况的初步研究发现，转醛醇酶的表达对其生长有一定的影响。关键词；转醛醇酶基因启动子运动发酵单胞菌大肠杆菌ABSTRACTZymomonasmobilisisafacultativeanaerobicgram—negativebacterium．Itssugarabsorbtiona

5、ndethanolproductionismorerapidthanthatofSaccharomycescerevisaeHowever,thesubstrateutilizedisrestrictedtoglucose．fructoseandsucrose．ThispaperdealswithcloningofE．colfK-12talBanditsexpressioninZmobilisCP4．Itisapartworkoftheprojcot：thegeneticrecombinationofzmobilisCP4foru

6、tilizationofxylosetoproduceethan01．EcoliK-12ta／Bwasclonedatfirst．anditsownpromoterwasreplacedwithenopromoterfromZmobilisCP4byPeR-mediatedoverlapextension，theresultinggenePeno—talB．GenetalBandgenePeno—talBwereligatedwiththeshuttlevectorpZBlrespectively,resultinginforma

7、tionofrecombinantplasmidspZBl-talBandpZB1一Peno—talB．ThenthetransaldolaseactivityoftransformantsE．coliDH50(pZB1一talB)andDH50日(pZBl一Peno—talB)weremeasured．111eresultswereshownasfollows：DH50d@ZBl一talB)，0．106U／mgprotein；DH5a(pZBI—Peno—talB)，0．109U／ragprotein；DH5a(pZBI)，O．

8、05U／mgprotein．pZBl一talBandpZBl一Peno—talBplasmidswerealsotransformedintoz-mobilisCP4．ThetransaldolaseactivityoftransformantsZ