运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建及大肠杆菌k-12 talb基因的表达

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1、天津大学硕士学位论文运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建及大肠杆菌K-12talB基因的表达姓名：葛建平申请学位级别：硕士专业：化学工艺指导教师：张敏华20050101中文摘要运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性菌，微好氧生长。Z．mobilis是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一，被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种。Z．mobilis可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖，利用基因工程手段改造Zmobilis，拓宽其可利用碳源的范围，是当前Z．mobilis基因工程改造工作的首要任务之一。基因工程改造首先需要有好的载体

2、系统。本研究以Z．mobilisATCCl0988中内源质粒pZM2(2749bp)和E．coli中的质粒pBR328(4907bp)、pACYCl84(4245bp)为出发质粒，构建Z．mobilis—E．coli之间的克隆型穿梭质粒。首先分别制备含pZM2的复制区和分配区的DNA片段，捅入到pBR328的四环素抗性基因中，构建出pZB2(Ap‘、Cmr，pZM2复制区)和pZB3(Ap‘、Cmr，pZM2复制区和分配区)；进一步分离pACYCl84中的四环素抗性基因DNA片段，分别连接到pZB2和pZB3中，得到p

3、ZB21(Ap‘、Cmr、Tcl，pZM2复制区)和pZB31(Apl、Cml、Tc。，pZM2复制区和分配区)；然后分别对pZB21、pZB31在E．coliDH5cr和ZmobilisCP4中的稳定性、拷贝数进行了比较分析，结果是：pZB2l、pZB31都优于实验室先前构建的pZBl，而pZB31又优于pZB21，故选定pZB31作为穿梭载体。最后，以pZB31为载体，在Z．mobilisCP4中表达E．coliK-12的ta／B基因，酶活水平达0．051U／mg蛋白，高于以pZBl为载体的相同基因的表达水平(为0

4、．035U／rag蛋白)。通过以上工作，构建得到了一个能满足使用要求的、较为理想的Z．mobilis—E．coli之间的穿梭载体即pZB31，其具有与pBR328完全相同的抗性标记。关键词：运动发酵单胞菌穿梭质粒稳定性拷贝数ABSTRACTZymomonasmobitis,afacultativeanaerobicgram—negativebacterium，hasahigherethanolyieldandspecificethanolproductivitythantraditionalSaccharomyes．S

5、p，soZ．mobilishasbeenevaluatedasapossiblecandidateforindustrialethanolproduction．However,itssubstraterangeisrestrictedtoglucose，fructoseandsucrose．V％orldwideattemptstointroduceheterotogousgenesintoZmobilistoexpanditssubstraterangebygeneticmanipulationarebeingcarr

6、iedoutandvariousdegreesuccesseshavebeenachieved．Itisnecessarytoconstructefficentshuttlevectorsforgeneticmanipulation。InthispapernewshuttlevectorsbetweenZmobilis-E．coliareconstructedfromthe2．7kbcrypticplasmidpZM2ofZmobilisATCCl0988、4．9kbplasmidpBR328and4．2kbplasm

7、idpACYCl84ofE．coli。TheDNAfragmentscontainingtheoriginofreplicationsitesandtheputativepartitionlocusa∞preparedfirstandinsertedintopBR328toconstructpZB2(Ap’，Cmr，oriofpZM2)andpZB3(Ap‘，c吐oriandparofpZM2)respectively．ThenwepreparetheDNAfragmentcontainingTc。geneofpACY

8、Cl84andligateittopZB2andpZB3toconstructpZB21(Apr,Cmr，k‘，ofiofpZM2)midpZB3l(Apr,fIltrTff,oriandparofpZM2)respectively．Weox黝thestabilityandcopynumberofpZB21andpZB31inE．