鸡肝脏和骨骼肌mirna表达和功能研究

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1、摘要肝脏代谢和骨骼肌发育是鸡十分重要的两个生物过程，microRNA(miRNA)是一类小的非编码的约22个核苷酸长度的单链RNA分子，是基因表达的重要调控因子，其对肝脏代谢和骨骼肌发育发挥了重要的作用。本研究以鸡肝脏和骨骼肌miRNA为研究对象，对其进行了一系列的表达和功能研究，主要研究结果如下：(1)运用实时荧光定量PCR检测miR-122的组织表达，发现其在肝脏中表达量最高。运用靶基因预测软件预测出364个miR-122的靶基因，挑选其中与肝脏代谢相关的预测靶基因P4HAl、PKM2、TGF—B3

2、、FABP5和ARCNl。实时荧光定量PCR显示而R一122在肝脏生长发育过程中上调，在鸡肝细胞离体培养过程中下调，5个基因在肝脏生长发育过程中表达不受影响，P4HAl、TGF．p3和ARCNl在肝细胞离体过程中下调，而FABP5在离体和培养过程中分别下调和上调，PKM2不受影响。体外双荧光素酶报告系统和靶位点突变实验证明5个基因及预测靶位点分别是miR．122的靶基因和靶位点，通过鸡细胞系过表达miR-122证明其对TGF．D3的调控在mRNA水平，而对P4HAl、PKM2和ARCNl的调控不在mRN

3、A水平，表明miR-122可能通过调控这几个基因在鸡肝脏代谢中发挥调控作用。(2)原代鸡肝细胞抑制miR．122后通过转录组测序发现共有123个基因差异表达，其中64个基因表达显著上调，59个基因表达显著下调。GO分析显示21个基因参与鸡肝脏代谢过程，表明miR-122可能通过影响这些基因而调控鸡肝脏代谢。通过比较测序及实时荧光定量PCR结果发现miR-122抑制后靶基因P4HAl、PKM2、TGF-p3上调，FABP5下调，而ARCNl不受影响，WesternBlotting分析表明靶基因P4HAl蛋

4、白上调，进一步说明miR-122可调控这些靶基因。(3)使用RNA干扰技术干扰原代鸡肝细胞中miR-122靶基因TGF一133后发现TGF-p通路下游基因ACTA2表达上调，LEFl和CCNB2表达下调，表明miR-122通过调控TGF．D3可能影响这些基因进而调控肝脏代谢。(4)运用实时荧光定量PCR检测miR．126的组织表达，发现其在肝脏中表达量很少。运用靶基因预测软件预测出54个miR．126的靶基因，挑选其中与肝脏代谢相关的预测靶基因Spredl。实时荧光定量PCR显示miR．126在肝脏生长

5、发育过程中上调，在鸡肝细胞离体培养过程中下调，Spredl表达不受影响。体外双荧光素酶报告系统和靶位点突变实验证明Spredl及预测靶位点分别是miR．126的靶基因和靶位点，通过鸡细胞系过表达miR．126证明其对Spredl的调控不是在mRNA水平，表明miR-126可能通过调控Spredl在鸡肝脏代谢中发挥调控作用。(5)使用鸡生长激素cGH处理原代鸡肝细胞，运用高通量测序技术对其miRNA进行测序，共鉴定出216个鸡miRNA，其中受cGH影响的miRNA有56个，29个表达显著上调，27个表达

6、显著下调，这些miRNA可能参与鸡肝脏代谢过程。(6)运用实时荧光定量PCR检测miR-la的组织表达，发现其在骨骼肌中表达量很高。运用靶基因预测软件预测出247个miR-la的靶基因，挑选其中与肌肉发育相关的预测靶基因ACVRl和Spredl，还有一个之前预测是miR．133a的靶基因后来验证其是miR-la的靶基因CNBP。实时荧光定量PCR显示miR-la在腿肌生长发育过程中表达有波动，4周时表达量高于其他时期，ACVRl和Spredl表达不受影响，CNBP先下调后上调。体外双荧光素酶报告系统证明

7、3个基因是miR-la的靶基因，靶位点突变实验证明ACVRl和Spredl的预测靶位点是miR-122的靶位点。通过鸡细胞系过表达miR-la证明其对Spredl的调控在mRNA水平，而对ACVRl和CNBP的调控则不是在mRNA水平，表明miR-la可能通过调控这几个基因在鸡骨骼肌发育中发挥调控作用。(7)运用实时荧光定量PCR检测miR．133a的组织表达，发现其在骨骼肌中表达量很高。运用靶基因预测软件预测出287个miR．133a的靶基因，挑选其中与发育相关的预测靶基因BIRC5。实时荧光定量PC

8、R显示miR-133a在腿肌生长发育过程中先下调后上调，BIRC5表达不受影响。体外双荧光素酶报告系统和靶位点突变实验证明BIRC5及预测靶位点分别是miR．133a的靶基因和靶位点，表明miR-133a可能通过调控BIRC5在鸡骨骼肌发育中发挥调控作用。关键词：鸡；肝脏IIliI斟A；骨骼肌miRNA；表达；功能一‘andfunctionofmiRNAsinchi(；kenliv(mdlheexpressionandtunctlonoml