阿德福韦酯治疗失败慢乙肝患者hbv逆转录酶区新变异rtn236v的表型耐药特点分析

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1、分类号R36密级公开恻㈣㈣88㈣4Y2441学校代码10601编号1001029川IIHillIIIll』硅咎诬告吃GUILINMEDICALUNIVERSITY硕士学位论文阿德福韦酯治疗失败慢乙肝患者HBV逆转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析学科专业：病理学与病理生理学乙肝病毒基因变异及其研究方向：临床意义的分析研究生姓名：王晓学号：Y1001029学位类型：科学学位导师姓名徐东平教授：刘妍副教授二0一三年四月独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过

2、的研究成果，也不包含未获得(洼!如遗查基丝盂蔓挂别直咽数!奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：千醇．签字日期：加f弓年占月易日少Ⅵ^／学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权桂林医学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社、中国科学技术信息研

3、究所将本学位论文收录到《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》、《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：王啦导师签字：乡红争辱．f签字日期：切弓年彳月舌日签字日期：知侈年／月‘日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1ABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2英汉缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯．．5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7日lJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯471材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．1研究对象⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．2实验主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．81．3实验主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4患者HBVDNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．5HBVDNA巢式PCR扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．6PCR扩增产物的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯121．7HBVDNA的克隆及测序分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．8pTriEx．rmv(c)1．1倍重组载体的构建及鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．9转

5、染级质粒的提取及浓度的测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯201．10转染试剂条件优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．11重组载体质粒转染HepG2细胞并加药培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯241．12各变异病毒株复制力的检测及其对药物敏感性的实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯242结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．1琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．2扩增产物HBVRT区TA克隆测序及其基因型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯252．3重组载体质粒酶切鉴定及测序鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．4不同转染试剂及方法的转染效率的比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3

6、42．5各变异病毒株复制力水平及其表型耐药特点分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯384结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48攻读学位期间发表的学术论文目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯60致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61阿德福韦酯治疗失败的慢乙肝患者HBV逆转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析中文摘要目的：核苷酸类似物阿德福韦酯是临床常用的抗乙型肝炎

7、病毒(hepatitisBvirus，皿V)药物，然而长期使用会导致耐药的发生。经典的阿德福韦酯耐药变异形式为rtN236T和rtAl81V，关于rtN236位点尚未见其他耐药相关变异的报道。本研究旨在鉴定分析两例阿德福韦酯治疗失败的慢性乙肝患者HBV逆转录酶(reversetranscriptase，RT)区新变异rtN236V的表型耐药特点。方法：1．分别从两例阿德福韦酯治疗失败的慢乙肝患者血清中提取HBVDNA，采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增HB