调控npm对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究

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1、硕士学位论文论文题目调控NPM对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究研究生姓名余秀琴指导教师姓名钱齐宏专业名称皮肤病与性病学研究方向光皮肤病学论文提交日期2013年4月调控NPM对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究中文摘要调控NPM对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究中文摘要目的：本研究观察使用小分子干扰RNA（siRNA）沉默NPM基因表达对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞状态及黄芩苷作用的影响，旨在明确NPM在皮肤癌发生进程的作用以及加深人们对皮肤肿瘤发生分子机制的理解。方法：1、细胞培养：人皮肤鳞状细胞癌A431细胞用

2、含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基培养于37℃、5%二氧化碳的培养箱中。2、药品配制：将1ML二甲基亚砜（DMSO）作为溶媒加入黄芩苷粉末中，配制成40mg/ml的储存液于棕色容器中，置入-20℃的冰箱中备用。本实验中，黄芩苷的终浓度为50μg/ml。3、siRNA干扰：针对NPMmRNA序列设计合成特异性siRNA，转染A431细胞，并在相应时间加入50μg/mL黄芩苷孵育，采用实时定量PCR（Real-timePCR）法检测NPM基因沉默效果。4、细胞增殖活性检测：以细胞增殖/毒性检测试剂盒（ce

3、llcountingkit-8，CCK8）法检测A431细胞增殖活性的变化。5、细胞周期检测：流式细胞术检测A431细胞周期的变化。结果：1.经过比较不同转染试剂与siRNA的滴度，并通过观察FAM绿色荧光，我们获得了良好的转染效率；实时定量PCR结果显示，各转染组细胞中的NPMmRNA的相对表达量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明NPM表达受到明显抑制。我们选取沉默效果最好的siRNA片段进行后继实验。2.与空白对照组比较，单独以NPMsiRNA转染细胞24h、48h、72h后，细胞的增殖速度

4、明显降低；而在加入黄芩苷孵育后，A431细胞的增殖活性显著降低，而随I中文摘要调控NPM对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究着时间延长，细胞的活性有所增高，但是仍然低于空白对照组；而当黄芩苷合并NPMsiRNA一起处理时，对A431细胞的增殖活性抑制作用最显著，且随着时间的延长而无增强，表明NPM基因沉默后A431细胞增殖活性显著降低，黄芩苷孵育亦可抑制细胞增殖活性，而NPM基因沉默可明显增强黄芩苷的作用；3.与对照组相比，siRNA沉默NPM后，A431细胞S期细胞百分率增加，而G2/M期细胞百分率减少；当单纯加

5、入黄芩苷孵育后，S期细胞百分率增加；且黄芩苷合并NPMsiRNA一起处理时，S期细胞百分率进一步增加，而G2/M期细胞百分率下降，这表明A431细胞在上述各种条件下均发生S期阻滞，使细胞分裂生长活性受到抑制。结论：通过siRNA沉默NPM基因的表达可明显降低人皮肤鳞状细胞癌A431细胞的增殖活性，并引起细胞周期阻滞，表明细胞的生长受到显著抑制。这提示NPM基因可能在皮肤肿瘤的发生过程中具有调控作用，并可能作为皮肤肿瘤基因治疗的潜在靶点。而黄芩苷对人皮肤鳞癌细胞有一定的抑制增殖作用，NPM可能是其抗癌活性的重要靶点

6、，但具体机制尚待进一步研究。关键词：NPM；黄芩苷；皮肤鳞癌；细胞周期；细胞增殖作者：余秀琴指导老师：钱齐宏闵玮II调控NPM对人皮肤鳞癌细胞增殖活性的影响研究英文摘要EffectsofregulatingNPMontheproliferativeactivityofhumanSCCA431cellsAbstractObjective:ThepresentstudyistoinvestigatetheeffectofsilencingNucleophosmin(NPM)genewithsmallinterferi

7、ngRNA(siRNA)andbaicalinoncellstateofhumanskinSCCA431cellline,whichtoclarifyandexplorethebiologicalactivityofNPMintheprocessofskincanceranddeepentheunderstandingofthemolecularmechanismsofskintumor.Methods:1.Cellculture:A431cellswereculturedinHigh-DMEMmediumwit

8、h10%fetalbovineserumandcellsweremaintainedinanincubatorwith5%carbondioxideat37℃.2.Preparationofbaicalin:Preparebaicalinwith1MLDimethylsulfoxide,theconcentrationofstocksolutionis40mg/ml,pl