rna干涉抑制htert对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制的研究论文

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1、缩略词RNAi英文全称英文缩略词表shRNAsmallhairpinRNA中文全称RNA干涉小片段干涉RNA小片段发卡样RNAhTERThumantelomerasereversetranscriptase人端粒酶逆转录酶RISC西豫口1RNA-inducingsilencingcomplexRNA诱导沉默复合物humantelomeraseRNA人端粒酶RNAtelomeraseassociatedproteinl端粒酶相关蛋白1GAPDHglyceraldehydephosphatedehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶TRAPtelomericrepeatamplificati

2、onprotocol端粒重复序列扩增法MOIFISHPNAmultiplicityofinfection感染复数fluorescenceinsituhybridization荧光原位杂交peptidenucleicacid核酸肽直赢匡抖盍堂簋±堂僮途童论文独创性声明本论文坐王造控剑堕!垦墼挝照厦擅麴照生篮整堕丞扭里盟至L是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。专业：拉经生I型作者签名：血盈咯日期：论文使用授权声明本人完全了

3、解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：导师签名：j弛日期：RNA干涉抑制hTERT对人脑胶质瘤细胞生长影响及机制研究第—部分：靶向hTERT小片段干涉RNA表达载体的构建和表达【目的】构建靶向hTERT的小片段鼢舱(siRNA)表达载体，为研究RNA干涉(RNAi)在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础．I方法】根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框，连接入质粒载体pRNAT-H1．1／

4、Neo，转染293T细胞，荧光定量RT-PCR和westernblot法检测转染后293T细胞中hTERT表达。【结果】重组质粒经测序鉴定证明hTERTsiRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT-H1．1／Neo质粒中，并筛选出一个抑制hTERT表达效率最高的序列，其hTERT表达仅达22．90％．【结论】成功构建并筛选出一个抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表达载体，为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础。第二部分：靶向hTERTsiRNA慢病毒表达载体的构建【目的l通过构建靶向人端粒酶催化亚基(hTERT)RNAi慢病毒载体，获得可供转染的滴度，为下一步研究该基

5、因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。【方法】根据hTERT设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链插入到pLVTHM质粒，生成合RNAi盒的载体，然后与pCMV-dR8．74和pMD2G病毒包装所必须的元件经脂质体导入T293细胞，包装成慢病毒，收集上清浓缩病毒并检测其滴度．RT-PCR检测干扰后细胞内hTERT表达变化．【结果】将目的序列成功连接到载体上，并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒。RT-PCR和TRAP检测结果证实构建的hTERT-siRNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达和端粒酶活性。【结论】成功构建了携带靶向hTERT基因的RNAi慢病

6、毒载体。该载体能够有效抑制hTERT的表达和端粒酶活性，为以hTERT为靶点的胺质瘤基因治疗的后续研究奠定基础。第三部分：慢病毒介导的RNAi技术抑制hTERT表达对U87胶质瘤细胞的作用研究【目的】观测利用RNAi技术下调hTERT表达对U87人脑胶质瘤细胞的影响。【方法】将慢病毒为载体的靶向hTERTsiRNA构建体—Lt-I感染U87细胞，舍无效序列的慢病毒Lt-non作为空载对照，正常培养U87细胞作为阴性对照．RT-PCR检测hTERT表达，TRAP法检测端粒酶表达，MTT和流式细胞检测分析细胞增殖并口周期变化，荧光原位杂交检测端粒长度变化，TransweU法分析细胞侵袭力，观

7、测裸鼠皮下瘤生长．【结果】Lt-I可以明显下调hTERT的表达，端粒酶活性，细胞侵袭力和裸鼠皮下瘤生长。【结论】靶向hTERT的RNAi基因治疗能够抑制hTERT表达、端粒酶活性和细胞侵袭力，这些效应先于肿瘤细胞的端粒长度明显缩短前出现，表明hTERT在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，可作为胶质瘤基因治疗的优选靶基因．I关键词】hlmRT；RNA干涉；DNA表达载体；慢病毒属；基因治疗作者：赵鹏导师：傅震教授Studyontheeff