腺病毒介导的il24基因抑制人脑胶质瘤细胞增殖的机制研究

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1、腺病毒介导的IL24基因抑制人脑胶质瘤细胞增殖的机制研究【摘要】　　目的：探讨IL24抑制人脑胶质瘤细胞增殖的可能机制。方法：用腺病毒介导的IL24（Ad.IL24）及腺病毒空载体感染人脑胶质瘤细胞U251，通过荧光显微镜观察腺病毒的感染效率，RTPCR法检测IL24的转录水平；用MTT法、流式细胞仪检测IL24对U251细胞增殖的影响；用蛋白质印迹方法检测神经生长因子（NGF）、酪氨酸激酶受体A（tyrosinekinaseA,TrkA）的表达水平，并分析其相关性。结果：Ad.IL24及腺病毒空载体转染U251后，RTPCR结果显示Ad.IL24组出现高表达电泳条带，而腺

2、病毒空载体组则未出现电泳条带；MTT结果显示Ad.IL24明显抑制了U251细胞的增殖，且流式细胞仪细胞周期检测发现Ad.IL24处理组较对照组G2/M期明显延长，蛋白质印迹结果显示过表达IL24的U251细胞中NGF及TrkA表达降低。结论:IL24可能通过减少细胞中TrkA和NGF的表达来抑制肿瘤细胞的增殖。【关键词】白细胞介素24；神经生长因子；酪氨酸激酶受体A；增殖；胶质瘤细胞　　［Abstract］Objective:ToinvestigatetheeffectofAdIL24onproliferationofgliomacellsandexploreitsprobabl

3、emechanism.Methods：U251iningthetranscriptionlevelofIL24,MTTandFACSforinvestigatingtheeffectofIL24ontheproliferationofU251,TT法检测Ad.IL24对U251细胞增殖的影响　　用含10％小牛血清的DMEM配成浓度为1×105/ml的细胞悬液，加入96孔培养板，每孔100μl，37℃、5%CO2孵育过夜后，分别按终浓度1∶50，1∶100，1∶200，1∶400加入Ad.IL24及腺病毒空载体作为对照，每组设3个复孔，37℃、5%CO2孵育72h后，每孔加MTT(5mg

4、/ml)10μl，继续孵育4h后加入溶解剂10%SDS，1%HCl(1mol/L),每孔100μl，37℃孵育，6h后在酶联免疫检测仪上测D(570nm)值，并计算相对增殖率。　　1.2.5流式细胞仪检测Ad.IL24处理对U251细胞周期的影响　　将U251细胞种在6孔板中，24h后，加入Ad.IL24及腺病毒空载体，培养48h后，用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗涤2次,各加入1ml的PBS重新悬浮细胞并计数,制成约1×106/ml的单细胞悬液0.5ml，迅速加入到4ml70%的冷乙醇中，充分混匀，4℃下固定24h，用流式细胞仪观察Ad.IL24处理对U251细胞周期的影响

5、。　　1.2.6蛋白质印迹检测Ad.IL24感染U251细胞后的NGF，TrkA表达水平　　Ad.IL24感染U251细胞48h后，收集细胞，PBS洗2次，加入裂解缓冲液，冰上放置30min。然后在4℃下，15000×g离心15min，收集样品并与上样缓冲液一起煮沸10min，进行SDSPAGE电泳，再将凝胶蛋白转印到硝酸纤维膜上，经5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗室温孵育2h，TBST缓冲液洗3次，再加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育1h，ECL发光液作用1min后以分子成像系统扫描仪记录实验结果，并进行定量分析。　　2结果　　2.1IL24基因在U251细胞中的表达　　　Ad.IL24

6、感染U251细胞48h后，荧光显微镜观察细胞，Ad.IL24在浓度1∶200时感染效率达95%以上(见图1a)。RTPCR结果显示,Ad.IL24感染U251细胞组在621bp处出现高表达电泳条带，而腺病毒空载体组则未出现电泳条带，表明IL24在U251细胞中过表达，见图1b。　　2.2Ad.IL24对U251细胞增殖能力的影响　　腺病毒空载体和Ad.IL24按照不同的浓度（1∶50～1∶400）感染U251细胞，72h后，用MTT方法分析U251细胞相对增殖率,结果见图2。　　图2表明随着浓度的降低细胞相对增殖率增加，当达到1∶400时，相对增殖率接近对照组。高浓度（1∶50，1

7、∶100）感染细胞后，在48h后在倒置显微镜下（数据未给出）可见多数细胞死亡，所以相对增殖率较低。因此，我们在下列实验中使用1∶200的稀释度。　　2.4Ad.IL24对NGF，TrkA表达水平的影响　　Ad.IL24感染U251细胞48h后，蛋白质印迹法检测显示TrkA和NGF的表达水平明显降低，但Ad.IL24对NGF的表达水平影响相对较小，可能是因为Ad.IL24早期感染细胞24h内