平瘤合剂PLM对人脑胶质瘤细胞(SHG44)增殖抑制的实验研究

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1、平瘤合剂（PLM）对人脑胶质瘤细胞(SHG-44)增殖抑制的实验研究作者：霍介格杨炳奎曹振健王小宁【摘要】　　目的观察平瘤合剂（PLM）对荷瘤鼠的治疗效果，探讨其作用机理。方法建立动物模型，灌服PLM，观测其抑瘤效果，并通过形态学、免疫组化、流式细胞仪等方法探明其作用机理。结果①PLM有较好的抑制SHG-44移植瘤增殖的效果，并呈现出一定的量效关系，且安全无毒作用；②流式细胞仪检测发现在治疗组中细胞凋亡增多，主要是使细胞阻滞于G0-G1期；③GFAP在高剂量组中高表达；④组织形态学上显示肿瘤的恶性程度有

2、降低趋势，并在透射电镜下可见SHG-44细胞凋亡现象。结论PLM能抑制实验性荷瘤鼠肿瘤的生长，其抗瘤机理是通过诱导细胞的凋亡，抑制胶质瘤细胞的增殖，并通过诱导其分化进而降低了胶质细胞瘤的恶性程度。【关键词】平瘤合剂；胶质细胞瘤；细胞凋亡8　　胶质瘤是神经外科常见的恶性疾病，约占颅内肿瘤的40%，虽然手术治疗是目前临床上的首选方法，但仍难以根除，具有很高的复发率，平均生存期6个月，综合治疗生存期不足两年［1］。人们一直在探索各种新的治疗方法。中医药疗法具有提高机体免疫力，改善症状，延长生存期的作用，笔者通

3、过对临床上使用有效的平瘤合剂（PLM）这一方药进行实验研究。现报道如下。　　1材料　　1.1实验细胞人脑胶质瘤细胞系SHG-44为高度恶性的人脑胶质瘤细胞，由苏州大学附属二院脑肿瘤研究所提供。　　1.2实验动物NC系裸小鼠为苏州大学附属二院动物中心提供，按SPF级要求管理，鼠龄6～8周，体重约为22g左右，雌雄兼用，随机分为高剂量（PLMH）、低剂量（PLML）及对照(NS)3个观察组，每组12只。　　1.3受试药物PLM由莪术、蛇六谷、川芎等中药组成，煎制成1∶1的浓度（每毫升中含有生药1g）。　　1

4、.4主要试剂与仪器小鼠抗人GFAP单抗、羊抗小鼠FIRC抗体均购自华美公司。流式细胞仪为BectonDickinson公司的FACSCslibur型；透射电镜为日立公司H-600型。　　2方法　　2.1模型建立将指数生长期的SHG-44胶质瘤细胞约1×8107穿刺接种于裸小鼠的右腋皮下，待瘤体生长至3mm3时将鼠断颈处死，取出瘤块，剪碎，按上述方法传代，待生物学性能稳定，致瘤率为100%时用于实验。　　2.2给药方法将原液以生理盐水倍比稀释一次后，制成高低两个剂量组，使用前高压灭菌备用，对照组给予生理盐

5、水。经口灌胃1次/d，0.8ml/次，连续6周。　　2.3体重及瘤体的测量每周1次测量体重并记录；用游标卡尺测量瘤体的长短径，根据公式W=a×b2/2(a为瘤体长径，b为短径)计算出瘤体体积；抑瘤率（%）＝（对照组肿瘤体积－治疗组肿瘤体积）/对照组的肿瘤体积×100%。　　2.4细胞凋亡检测将荷瘤鼠断颈处死，迅速取出瘤块，置冰块上剪碎，PBS洗涤，过300目尼龙滤网，制备单细胞悬液，收集好的细胞离心、洗涤后，用1mlDNA染液（PBS含1%Triton-X-100、0.5μg/mlPI染料、20μg/m

6、lRnase）室温染色30min，过300目尼龙滤网，上机检测。　　2.5GFAP的表达取瘤组织石腊包埋，常规病理切片，按照实验方法制片［2］，上镜观测。8　　2.6病理观察病理切片的制作方法同上，常规HE染色，显微镜下观察各组的病理表现和特点。　　2.7肿瘤组织的亚微结构取一小块瘤体剪成约1mm×1mm×1mm的小块，浸入4%的戊二醛里固定2h，后以PBS洗涤2次，15min/次，再以1%的锇酸固定1h，PBS洗涤后以浓度渐升的丙酮进行梯度脱水，用环氧树脂618包埋，渗透，聚合48h后，用醋酸铀-柠檬

7、酸铅染色后在日立H-600透射电镜下观察。　　2.8统计学处理实验数据采用SAS软件分析，进行统计学处理。　　3结果　　3.1PLM对荷瘤鼠抑瘤作用的观察结果见表1。　　表1各组瘤体积的变化（略）　　与对照组的比较，**P<0.01，*P>0.05；n=12　　3.2体重的变化见表2。8　　3.3流式细胞仪检测细胞周期分布：主要使细胞阻滞在G0/G1期，S期的比例明显随着剂量的增加逐渐减少。见表3。　　3.4GFAP表达PLMH组中棕染细胞明显增多，PLML及NS两组中相对较少。　　3.5组

8、织病理NS组可见肿瘤细胞密集，细胞呈多形性，间质成分少，细胞核的形态异型性明显，胞浆少，细胞的极性消失，中间有较多的坏死及出血灶。PLML组中的肿瘤细胞较为密集，胞浆丰富。PLMH组中可见细胞排列整齐，胞核呈长梭形，间质成分明显增多，未见有出血及坏死的病灶，在近边缘的部位尚可见有淋巴细胞浸润。　　3.6凋亡肿瘤细胞的亚微结构观察在电镜下可以清晰观察到在PLMH组中细胞核固缩现象，并出现典型的凋亡小体，部分细胞可见染色质边集的早期凋亡表现。