重组人il-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响

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1、博士学位论文论文题目重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响研究生姓名王云指导教师姓名刘春风专业名称神经病学研究方向胶质瘤基础及临床研究论文提交日期2013年9月重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响中文摘要重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响中文摘要胶质瘤是人类最常见的颅脑肿瘤，传统的治疗方法包括手术、放疗和化疗，治疗效果有限。研究发现脑肿瘤干细胞（braintumorstemcell，BTSC）的存在是胶质瘤复发、转移的主要原因，以BTSC为治疗靶细胞，尤其是诱导BTSC的分化治疗为胶质瘤治疗提供了新途径。

2、白介素-24（Interleukin-24，IL-24）是近年发现的、具有细胞因子样特性的肿瘤抑制基因，具有抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡的广谱抗肿瘤活性。最近研究发现IL-24在造血系统恶性肿瘤中能够诱导肿瘤细胞向成熟单核-巨噬系分化。IL-24对肿瘤干细胞的增殖和分化的影响尚未见报道。因此，本课题拟研究IL-24对BTSC增殖和分化的作用，本研究分以下三部分阐述：第一部分IL-24表达质粒的构建及重组蛋白的表达、纯化目的：构建白介素-24（Interleukin-24，IL-24）的原核表达质粒pET28a-IL24，利用其转化BL2

3、1(DE3)菌株，表达重组蛋白IL-24，通过鉴定、纯化、复性获得重组蛋白IL-24。方法：利用分子生物学技术，将IL-24的cDNA插入到表达质粒pET28a(+)，通过酶切、测序鉴定重组载体。鉴定正确重组质粒转化菌株BL21(DE3)进行蛋白表达，SDS-PAGE电泳和WesternBlotting鉴定，确定目的蛋白的表达。通过重组工程菌的诱导培养，获得重组蛋白IL-24包涵体。洗涤后利用目的蛋白携带的6×His纯化标签，采用镍离子亲合层析纯化蛋白IL-24。通过透析复性使目的蛋白正确折叠。结果：成功构建IL-24表达质粒pET2

4、8a-IL24，DNA测序结果显示，IL-24序列与Genebank（NCBIReferenceSequence:NG_029565.1）序列完全吻合。重组表达质粒pET28a-IL24转化表达菌株后，经诱导培养，收获菌体总蛋白经SDS-PAGE电泳I中文摘要重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响并考马斯亮蓝染色后，分析表达目的蛋白IL-24约占菌体总蛋白的36.47%，且目的蛋白的表达形式主要为包涵体。洗涤溶解后采用镍离子亲合层析得到纯度为90%以上的重组人IL-24（RecombinantHumanInterleukin-

5、24，rhIL-24）。复性的rhIL-24蛋白冷冻抽干后-20℃保存。结论：成功构建IL-24的原核表达质粒pET28a-IL24，在大肠杆菌高效表达重组蛋白IL-24，采用镍离子亲合层析法获得rhIL-24，为下一步实验奠定基础。第二部分胶质瘤细胞U251中脑肿瘤干细胞的分选、鉴定目的：采用无血清悬浮培养和免疫磁珠分选相结合的方法进行人脑胶质瘤U251细胞系中脑肿瘤干细胞（braintumorstemcell，BTSC）的分选，并鉴定。方法：首先将U251细胞接种于含有生长因子的无血清培养基，通过悬浮培养法得到含有大量BTSC的脑

6、肿瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球上的表达。分离脑肿瘤干细胞球中的BTSC，运用CD133标记的免疫磁珠对BTSC进行分选和纯化，并用流式细胞仪检测分选后BTSC的CD133表达阳性率。通过MTT法和细胞单克隆形成率实验检测分选的CD133+的BTSC的增殖活性。结果：U251细胞在含血清的培养液中呈贴壁生长，增殖活跃。U251细胞接种于无血清培养基后，24至48小时内大部分细胞贴壁，一部分细胞呈单细胞悬浮状态；并有一部分细胞发生非特异聚集。培养72小时后开始形成细胞球，悬浮于培养基中，随后细胞球逐

7、渐增大，形成典型的脑肿瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测显示CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球上的高表达。利用免疫磁珠分选技术纯化CD133+细胞，流式细胞仪检测脑肿瘤干细胞球中的细胞经分选后，CD133+细胞比例达到95.8％。MTT检测发现CD133+细胞的增殖能力显著强于CD133-细胞；同时CD133+细胞单克隆形成率高，而CD133-细胞几乎不能形成典型的脑肿瘤干细胞球。结论：U251经含有生长因子的无血清培养液悬浮培养后，能够形成典型的脑肿瘤干细胞球，且CD133+细胞比例显著增高。利用免疫磁珠分选技术从脑肿瘤干细胞球中分

8、选获得高纯度的CD133+细胞，且其增殖能力强。II重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响中文摘要第三部分rhIL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响目的：研究rhIL-24对CD133+的BTSC的增殖和分化的