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1、巨细胞病毒对造血干细胞增殖和分化情况的影响：赵秀荣，张凤英，赵连志，米术斌，王庆林【摘要】 目的探讨人巨细胞病毒(humancytomeglavirus,HCMV)对造血干细胞的增殖和分化情况的影响。方法采用造血干细胞体外培养技术,研究HCMV-AD169株对脐血造血干细胞增殖和分化情况的影响,采用PCR技术检测干细胞中的HCMVDNA.。结果HCMV在体外能明显抑制造血干细胞的增殖和分化,抑制程度随病毒浓度的升高而增大,经PCR检测病毒感染的细胞中有HCMVDNA的存在。结论HCMV-AD169对造血干细胞增殖和分化情况的有抑制作用。【关键词】巨细胞病毒造血干细胞
2、增殖分化 Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofhumancytomeglavirus（HCMV）onproliferationanddifferentiationofhematopoieticstemcell（HSC）.MethodsThetechnologyofcellcultureatopoieticstemcell,andthetechnologyofpolymerasechainreaction(PCR)anner.HCMVeglavirus;Hematopoieticstemcell;Proliferatio
3、n;Differentiation 人巨细胞病毒(Humancytomeglavirus,HCMV)感染非常普遍,人是HCMV的唯一储存库,HCMV原发感染后以潜伏状态持续存在，在某些特殊条件下可以被激活，而引起造血功能紊乱，表现为骨髓抑制、血小板减少、粒细胞减少、单核细胞增多症、贫血、肝脾肿大和免疫功能紊乱等［1］。我们采用造血干细胞体外培养技术研究HCMV-AD169对脐血造血干细胞的影响,用聚合酶链反应(PCR)法检测细胞内HCMVDNA,以探讨HCMV对造血干细胞的作用。 1材料与方法 1.1材料 脐血标本均来自于附属医院及妇幼保健院，病毒株HCMV-
4、AD169株由湖南师范大学提供，造血干细胞免疫磁珠分离试剂盒购于宁波新芝科技有限公司，DMEM及IMDM培养基购于GIBCOBRL公司。 1.2方法 1.2.1脐血单个核细胞［2］及CD+34细胞的分离 无菌法采集健康新生儿脐血,用DMEM培养液按1:1稀释,混匀后用吸管沿管壁缓慢叠加于淋巴分离液面上,水平离心2000r/min，30min，在上、中层界面处有一白色云雾层狭窄带仔细吸取单个核细胞，用5倍体积的DMEM培养液洗涤,1500r/min离心10min，重复两次。细胞沉淀用DMEM均匀配成单个核细胞悬液并记数。通过造血干细胞免疫磁珠分离系统分离CD+34
5、细胞。 1.2.2感染方式及分组 采用持续性感染方式，即HCMV直接加入到培养体系中混合培养。实验分对照组两组，分别是①空白对照组:不加HCMV病毒液，加入同体积的IMDM；②灭活对照组：加入同体积灭活HCMV病毒液（病毒液在紫外灯下照射15min灭活）；感染组分3组即1∶10，1∶100，1∶1000；分别直接加入0.1ml的1∶10，1∶100，1∶1000的HCMV-AD169DNA株病毒液与细胞混合培养。 1.2.3细胞培养将上步收集的细胞进行培养，按106/mlCD+34细胞密度培养，1ml体系中含有12.5%胎血清、100μg/ml链霉素、100U/
6、ml青霉素，IL-3，SCF各100ng/ml，5×10-7/ml氢化可的松，余体积用IMDM补充。培养于24孔板，每孔1ml，37℃培养于50mmol/LCO2及饱和湿度的培养箱中。每3d半量换液1次，在培养5，10，15，20d和30d时，用血细胞记数板分别计数细胞的增殖情况，染色后镜下观察细胞的分化情况。 1.2.4应用PCR技术检测造血干细胞中的HCMV-AD169DNA取上述培养液低速离心沉淀细胞弃上清液，用磷酸盐缓冲液低速离心洗涤2次，再用双蒸水洗1次，弃上清液，以去除细胞外残留病毒，提取DNA按PCR试剂盒说明书进行，在紫外灯下观察，有无特异的阳性扩增
7、带。 2.2干细胞内HCMV-AD169DNA检测 采用普通PCR技术检测5组细胞内HCMV-AD169DNA,在3个滴度病毒感染组均出现特异扩增带,空白对照组和灭活对照组无阳性扩增带。 方差分析：多组间有统计学意义(F=31.51,P<0.01),两两比较进行q检验:感染组与对照组间、感染组间均有统计学意义(P<0.05) 3讨论 人群中HCMV感染较为常见［3，4］，已有学者研究发现HCMV感染可伴随有血小板和粒细胞减少等造血系统异常的表现［5，6］但并未引起重视，后来一些学者证实，HCMV抑制机体晚期的造血作用，但HCMV
