短发夹rna沉默htert 基因抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的实验研究论文

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1、短发夹RNA沉默hTERT基因抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的实验研究论文孙卫东于如同马衍刚【摘要】目的研究靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹RNA（shRNA）对裸鼠人脑胶质瘤中hTERT基因表达的抑制作用，以及影响肿瘤增殖并诱导细胞凋亡的作用,为脑胶质瘤的基因治疗探讨新的依据。方法体外培养人脑胶质瘤U251细胞株，建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型。将成功造模的36只裸鼠随机分为3组（每组12只）。hTERTshRNA组肿瘤体内原位注射hTERT质粒shRNA（pshRNA）20μg+脂质体60μl+PBS；PBS组肿瘤体内原位注

2、射PBS150μl；空质粒组肿瘤体内原位注射空质粒20μg+脂质体60μl+PBS。观察肿瘤生长情况。苏木精-伊红染色观察肿瘤组织的病理改变，ethodsHumangliomaU251cells,culturedinvitro,odelsofhumangliomabysubcutaneousinjectionintonudemice.The36mousemodelsformedid(pshRNA)20μg+lipid60μl+PBS;thePBSgroup,giventhatofPBS150μl;theblankplasmidgrou

3、p,giventhatofblankplasmid20μg+lipid60μl+PBS.H-Estainedspecimensofthexenografttumoridtherapy,axiKit大提质粒（依其操作手册工作）。对获得的质粒hTERTpshRNA用DNA分析仪测光密度值（D值）并定量，再做酶切鉴定及测序。RPMI-1640培养基、SiPORTXP-1脂质体为Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青公司产品，AnnexinV-FITC试剂盒购自上海晶美公司，hTERT抗体购自SantaCrus公司。1.2细胞培养U251细

4、胞根据GibcoBRL公司的细胞培养手册在无菌层流超净工作台上完成细胞培养和传代后，将U251细胞接种于细胞培养瓶中，培养基为RPMI-1640，加10%胎牛血清，并加入青霉素、链霉素各100mg/L。培养条件：37℃、5%CO2培养箱，饱和湿度。倒置显微镜下观察，细胞处于80%～90%融合阶段时进行传代培养，一般2～3天传代1次。0.05%胰酶消化，0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗除胰酶，取其中1μl在光镜下用计数玻片计数，调整比率制成所需细胞悬液，以备种植。1.3实验动物分组及裸鼠人脑胶质瘤移植瘤模型的制备4～6周龄雄性

5、裸小鼠（BALB/cnude）40只，体重18～22g，购于复旦大学医学院实验动物中心，饲养于SPF级无菌饲养室。收集U251细胞，计数细胞数约5×106/只（鼠），加入0.3ml无血清无抗生素RPMI-1640培养液中制成细胞悬液，经微量注射器注入裸鼠左侧背部皮下，每2天观察肿瘤生成情况并用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积的计算方法参照公式：体积(mm3)＝a×b2/2，其中a代表肿瘤长径，而b则代表与a最大径垂直的宽度值（短径）。共成功建立皮下肿瘤模型36只，其余4只由于技术和细胞状态原因或其他原因导致肿瘤未生成而从实验中剔除。36

6、只肿瘤模型随机分成3组，每组12只：PBS对照组（简称PBS组，下同），肿瘤体内原位注射PBS150μl；脂质体包载的空质粒组（简称空质粒组，下同），肿瘤体内原位注射空质粒20μg+脂质体60μl+PBS；hTERTshRNA组，肿瘤体内原位注射hTERTpshRNA20μg+脂质体60μl+PBS。以上各组给药液体总量均为150μl。1.4给药治疗方法种植U251细胞后，待肿瘤增殖至100～150mm3大小，采用肿瘤体内原位给药方法：将皮下肿瘤分为4个象限，药物分为4份注射，给药部位波及瘤体周边反应带处。每72h给药1次，共5次。1

7、.5动物移植肿瘤取材和肿瘤标本切片裸鼠在治疗后第5周末断颈处死，取出肿瘤，测量肿瘤体积，计算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤体积/PBS对照组平均瘤体积）×100%。将新鲜肿瘤标本留作凋亡检测，余放至液氮保存。标本固定后，经石蜡包埋切片，采用常规苏木精-伊红染色，在光镜下观察肿瘤细胞形态、坏死、凋亡等改变。1.6hTERT蛋白的icrosoftExcel及SPSS11.0统计软件分析，计量数据以x±s表示，采用完全随机设计方差分析法进行统计学分析。检验水准：α=0.05。2结果2.1hTERTshRNA对裸鼠U251移植瘤增殖

8、的影响裸鼠背部皮下注射U251细胞后第8～10天出现可触及且肉眼可见的肿瘤组织。种植U251细胞约15天后，裸鼠移植瘤增殖至（132.5±16.4）mm3。瘤体内原位给药后，hTERTshRNA组肿瘤增殖明显比同期PBS