htert短发夹状rna抑制前列腺癌细胞生长的研究论文

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1、hTERT短发夹状RNA抑制前列腺癌细胞生长的研究论文平浩，张军晖，陈晓春，鲁功成【摘要】目的研究靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的短发夹状RNA（shRNA）基因转染对前列腺癌细胞体外生长的抑制效应及其促细胞凋亡作用。方法在脂质体介导下将针对hTERT基因的shRNA表达载体psilencerTRT转染前列腺癌细胞PC3m，得到稳定细胞株PC3m/shRNATRT。采用RTPCR检测hTERT基因表达情况，yc蛋白表达变化，细胞计数并绘制细胞生长曲线，Hoechst33258染色、透射电镜、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果

2、重组质粒psilencerTRT转录生成的shRNA使实验组细胞的hTERT基因表达显著下调.freelyc蛋白水平较对照组有明显下降，细胞的生长增殖能力也显著降低（P0.05），生长速率明显变慢，部分细胞呈现凋亡形态学改变，凋亡率为(19.69±4.75)％。结论hTERT短发夹状RNA能有效抑制前列腺癌细胞中hTERT表达及癌细胞生长，诱导PC3m细胞凋亡，可望为前列腺癌的基因治疗提供新方法。【关键词】端粒酶逆转录酶；短发夹状RNA；前列腺癌；凋亡RNA干扰是近几年发现和发展起来的一项新的基因阻断技术，由于其具有高效的抑制作用

3、，已广泛应用于医学的多个领域1。人端粒酶逆转录酶基因编码的端粒酶催化亚单位在大多数肿瘤中表达上调并对肿瘤细胞的端粒酶活性起重要调控作用，是目前肿瘤基因治疗中一个极具前景的靶点2。因此，本研究拟通过转染针对端粒酶hTERT的siRNA表达载体，使其在前列腺癌细胞PC3m内稳定产生特异性的短发夹状RNA(shorthairpinRNA,shRNA)，诱导RNA干扰，并探讨shRNA对hTERT、cmyc表达及细胞增殖和凋亡的影响，寻找新的前列腺癌基因治疗方法。1材料和方法1.1材料与试剂质粒psilencer2.1U6neo购自美国

4、Ambion公司。AnnexinⅤFITC试剂盒购自晶美生物技术有限公司。1.2shRNA表达载体的构建及鉴定本实验应用本组已成功构建的重组质粒psilencerTRT3，其合成步骤大致如下：针对hTERT基因靶点（TTTCATCAGCAAGTTTGGA）合成两条寡核苷酸链，它包括两端的BamHI和HindIII酶切位点及反向的两个一致的靶序列，被9bp的非同源序列的环间隔，3’末端加有TTTTTT终止序列。该正反两条寡核苷酸链退火得到双链DNA，并将该退火siRNA目的片段插入到psilencer2.1U6载体中，连接产物ps

5、ilencerTRT转化宿主菌DH5α并行测序鉴定；阴性对照质粒psilencerNC由人和鼠的非同源性靶序列构建合成。1.3细胞培养及稳定转染人前列腺癌细胞株PC3m接种于6孔板，在含10%小牛血清的DMEM培养基中生长至50%～70%融合。采用脂质体转染法稳定转染抑制质粒psilencerTRT和对照质粒psilencerNC，按照转染试剂盒说明书提供的步骤进行，将重组质粒与脂质体1∶3混合，G418筛选阳性细胞克隆并进行实验分组，转染psilencerTRT质粒的PC3m细胞命名为PC3m/shRNATRT（实

6、验组），转染psilencerNC质粒的PC3m细胞命名为PC3m/shRNANC（阴性对照组）。未转染质粒的亲本细胞PC3m作为空白对照组。1.4RTPCR检测hTERTmRNA的表达水平收集细胞，提取细胞总RNA，MMLV逆转录酶进行反转录，相应PCR反应体系中进行扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外线透射仪下观察拍照并行条带灰度分析，hTERT与βactin灰度的比值即为hTERTmRNA相对量A值。抑制率＝A实验组/A阴性对照组×100%1.5ax/Mad网络调节是一个重要环节［5，6］。质粒psi

7、lencerTRT瞬时转染前列腺癌细胞，明显降低了hTERT表达水平，并显著抑制端粒酶活性，从而证实了psilencerTRT转录产生的shRNA对hTERT基因的强大沉默效应，为RNA干扰治疗前列腺癌提供了基础［3］。目前，众多研究显示，抑制hTERT基因表达可选择性抑制肿瘤细胞中的端粒酶活性而导致抗肿瘤效应［7］。因此，本实验利用已构建的psilencerTRT重组质粒稳定转染前列腺癌细胞PC3m，得到稳定细胞株PC3m/shRNATRT，检测发现其hTERT基因表达显著降低，并且hTERT及cmyc蛋白水平明显下降

8、，说明短发夹状RNA不但抑制了hTERT基因，而且对其调控蛋白cmyc也有抑制作用，也进一步证实了RNA干扰质粒具有稳定性好、抑制作用强、细胞摄取相对容易等多种特点。此外我们还发现，实验组的前列腺癌细胞体外生长缓慢，倍