纤毛鹅观草dreb类基因rcdreb1的克隆及功能验证

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1、分类号：墅箜±：2密级：公珏单位代码：羔鳗墨鱼学号：垫羔Q2竖纤毛鹅观草DREB类基因RcDREBl的克隆及功能验证CLONINGANDFUNCTIONIDENTIFICATIONOFADI遇B．LIKEGENERcDRE8jINRD曰GNER别C见五4R学位申请人：赵艳红指导教师：刘桂茹教授温淑敏研究员学科专业：作物遗传育种学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二。一三年五月二十五日摘要干旱、高盐和低温等非生物胁迫是影响植物生长发育的主要限制因子，是造成我国农业生产减产的主要因素。非生物抗逆性的研究由编码某种特定产

2、物的功能基因向信号传导和基因表达调控等开关基因克隆的方向发展。分离并转移近缘野生植物抗逆的相关基因，使其能够在转基因植物中顺利表达，以提高植物的抗逆性，这已发展成为改良植物抗性的新途径。本文以纤毛鹅观草为材料，依据AP2家族保守结构域的氨基酸序列设计一对简并引物，通过RT-PCR和RACE技术，克隆了一个响应高盐干旱的纤毛鹅观草DREB类基因的全长cDNA序列，命名为RcDREBl。该基因全长1171bp，5，端有57bp的非翻译区，3，端具有完整的polyA尾。开放阅读框长为837bp，无内含子，编码278个氨基酸残基，含有一

3、个保守的AP2结构域，由60个氨基酸组成，第14位和19位为撷氨酸(V)和谷氨酸(E)。是AP2大家族的一个新成员。种系发生树分析表明，RcDREBl与小麦AP2家族DREB类基因高度同源。氨基酸序列相似性达到97％。构建了pET30a-RcDREBl原核表达载体。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明，目标基’因RcDREBl在大肠杆菌中得到了大量表达。根据氨基酸序列推算，其蛋白分子量为30kD左右，加上表达载体pET30a中的标签蛋白S-Tag，表达的融合蛋白分子量约为34．6kD左右。通过实时定量PCR分析了RcDREBl基因的表达特

4、性。实验发现，高盐、干旱、重金属镉和低温胁迫均可诱导RcDREBl表达，但其对高盐反应较为显著。构建了真核表达载体pGAD．RcDREBl，通过酵母单杂交试验验证鹅观草DREB蛋白的DNA结合域。将该融合表达载体转入酵母菌株，在含10mM3-AT的SD／Leu一，Ura-,His’平板上筛选转化子，检测报告基因的表达情况。结果表明RcDREBl蛋白具有DNA结合域的功能，能够特异结合DRE元件。为了进一步分析克隆到的RcDREBl转录因子基因的功能，本研究同时构建了以CaMV35S启动子驱动的含有RcDREBl基因的植物表达载体

5、pBll21．RcDREBl。通过农杆菌介导的叶盘浸染法进行了烟草转化，获得了Kan抗性烟草T0代转RcDREBl基因植株。本研究鉴定的新型转录因子基因为研究分析小麦族的进化和转基因应用奠定了基础。关键词：纤毛鹅观草；基因克隆；DREB；酵母单杂交；实时定量；真核表达CLONINGANDFUNCTIONIDENTIFICATIONOFADREB．LIKEGENERcDREBlINRoEGNERlACILIARGraduate：ZHAOYan-hongMajor：CropGeneticsandBreedingSupervisor：

6、Prof．L1UGui—ruWENShu-minAbstractAbioticstressofdrought，high—salinityandlowtemperaturearethemainfactorsaffectingplantsgrowthanddevelopmentandinfluencingtheagricultm'eproductioninourcountry．Onresistanceabioticstress，researchhadbeenchangedfromfunctiongeneswhichencodedso

7、mespecificproducttocloningswitchgene，includingsignaltransductionandgeneexpressionregulationgenes．Separateandtransferresistancegenefromrelativeswildplants，itisimportantthattheresistantgenesCanbeexpressedintransgenicplants，andhadbecomeanewwaytoforresistancecultivarbree

8、d．Inthispaper,usingapairofdegeneracyprimersdesignedaccordingtotheconservedaminoacidsequencesofAP2transcriptionfactorfamily,afull．1e