猪骨髓间充质干细胞的成骨分化及成骨细胞的传代培养

《猪骨髓间充质干细胞的成骨分化及成骨细胞的传代培养》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据Osteogenicdifferentiationofporcinebonemarrow-·derivedmesenchymalstemcellsandsubcultureThesissubmittedt01laeSlSsUb(趸ngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyGaoJian(ColleageofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：Prof．

2、SongXue-·xiongQingdao．ChinaJune，2013万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。一虢萄时间：2矽7歹／1年6月左／日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和

3、磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：l筠1娄时间：2口抄，1年6月Z／日吣讽：2。}三年毛RZ了＆万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要猪骨髓间充质干细胞的成骨分化及成骨细胞传代培养少口乡l＼摘要本研究用密度梯度离心和全骨髓贴壁筛选法分离培养了猪骨髓间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)，并对MSCs生物学特性进行了分析，用MSCs诱导分化成骨细胞，进而用分化的成骨细胞进行

4、了传代培养，为MSCs的成骨治疗临床应用及建立成骨治疗动物模型开拓新思路乖方法。试验的主要内容和结果如下：1从刚刚屠宰的猪股骨中抽取骨髓血，用密度梯度离心(密度为1．073g／mLpercoU分离液)和全骨髓贴壁筛选法在含15％FBS的低糖DMEM中分离培养。将原代获得的MSCs克隆团进行消化传代，对传代培养的细胞进行形态学鉴定。将传代获得的F1、F3、F6及F13代MSCs进行绘制生长曲线，结果显示随着细胞传代教增加细胞对数期维持时间逐渐下降。细胞学和细胞表面抗原检测显示，细胞传至F3代，已接近为纯化的MSCs。2本研究对分离获得的细胞进行

5、了生物学特性检测，同时对不同代细胞的染色体状态和各分裂期细胞形态变化进_gS-分析。结果显示，细胞传至第17代，细胞染色体形态仍正常，细胞分裂形态正常，细胞解冻后活力有所下降。3对F3、F5、F9代MSCs制备细胞爬片，利用细胞荧光免疫染色对爬片中固定后的MSCs进行表面抗原CD45、cD90、CDl05检测。结果显示CD90和cDl05阳性表达率分别为97．40／硅1．8％和99．6％--+0．9％，而CD45阳性表达率仅为1．80／硅0．55％，证实这些细胞具有MSCs表面抗原。4本研究检测了MSCs的成骨和成脂分化潜能，经21d成骨诱导

6、和18d的成脂诱导，成功诱导出成骨细胞核成脂细胞。5对诱导21d获得的成骨细胞进行传代培养，对传代细胞形态学、成骨细胞特定表达基因(osterix、osteopontin和osteocalcin)、以及成骨细胞特定分泌蛋白I型胶原蛋白和骨钙素进行了检测，成骨细胞传至第6代仍然多形性，接种培养第4d，成骨细胞开始出现发亮的钙磷灰石沉积物；成骨相关基因和蛋白质检测均显示阳性，且高于原代分化细胞。以上结果表明，从猪股骨骨髓中分离培养并纯化了MSCs，这些MSCs具有多向分化潜能，经诱导获得的成骨细胞可以传代培养，且保持和提高其成骨细胞特性，有望能够

7、成为骨病治疗的种子细胞，为临床骨病研究治疗提供了广阔的前景。关键词：猪NISCs；分离鉴定；诱导分化；成骨细胞再培养万方数据青岛农业大学硕士学位论文AbstractOsteogenicdifferentiationofporcinebonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsandsubcultureAbstractTheobjectofthisstudywasporcine，densitygradientcentrifugationandthewholebonemarrowadherentscreeningm

8、ethodswereusedtoseparatetheporcinemesenchymalstemcells，andthebiologicalcharacteris