牙鲆b细胞抗原受体辅助分子cd79b基因的克隆及其特性的研究

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1、万方数据牙鲆B细胞抗原受体辅助分子CD79b基因的克隆及其特性的研究学位论文答辩日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：万方数据谨以此论文献给母校中国海洋大学和所有关心支持我的亲人、师长和朋友陈书伟万方数据独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得(注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空)或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文

2、中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：曰翻功移签字日期：沙侈年江月／y日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论

3、文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：砾辖1移签字日期：k侈生g／2-月侈日翩粹一签字日期：加侈年肛月／7日万方数据牙鲆B细胞抗原受体辅助分子CD79b基因的克隆及其特性的研究摘要鱼类是低等脊椎动物一个代表性类群，是早期脊椎动物进化的一个必不可少的环节，鱼类免疫相关基因对于研究鱼类的抗病机制以及鱼类免疫系统的进化起着重要作用，因而获得了越来越多的关注。鱼类免疫相关因子包括固有免疫相关因子如模式识别受体、抗菌肽、补体、凝集素、干扰素、炎症细胞因子、趋化因子等，以及获得性免疫相关的因子包括主

4、要组织相容性复合物、免疫球蛋白、B细胞和T细胞抗原受体以及协同刺激分子等。其中B细胞抗原受体(BCR)参与B细胞的信号转导，不仅影响细胞选择、成熟、存亡，并且对B细胞最终效应因子如抗体的产生也至关重要。本论文牙鲆脾脏中克隆获得了BCR辅助分子CD79b的全长序列并研究了其在牙鲆各个组织的分布及转录水平，构建了原核表达载体获得了CD79b重组蛋白及其多克隆抗体，应用多克隆抗体研究了CD79b蛋白的特性及其在牙鲆淋巴细胞表面的分布规律。具体研究结果如下：(1)从牙鲆脾脏中克隆获得了B细胞抗原受体辅助分子CD79b的全长序列，

5、并分析了该基因的序列特征。牙鲆CD79beDNA全长1521bp，开放阅读框(ORF)长度为621bp，编码的氨基酸有206个，由信号肽、免疫球蛋白区(Ig区)、跨膜区和胞内区四个结构域组成。牙鲆CD79b含有类似哺乳动物CD79b的特征性的结构域，包括J铰链区和免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)等；同源性分析发现牙鲆CD79b氨基酸序列与另外几种硬骨鱼CD79b相似度在37％到49％之间，和哺乳动物CD79b的相似度稍低，在26％到32％之间。(2)利用RT-PCR的方法分析了CD79b基因在健康牙鲆各个组织的差异表达

6、，在脾、肾、血液、鳃中CD79b转录水平最高，肠、肝的转录水平次之，肌肉和胃的转录水平最低。利用实时定量PCR方法分析了BSA、LPS、灭活迟缓爱德华氏菌三种类型抗原刺激后牙鲆脾中CD79b基因的转录水平的变化，结果表明这三种抗原刺激后CD79b基因的转录水平在一段时间内都呈现先出明显的上调表达，而在LPS注射组中目的基因初始阶段有短暂的下调，而之后万方数据很快出现升高的趋势。LPS及迟缓爱德华氏菌注射组中CD79b上调表达的时间早于BSA注射组，上调幅度也高于BSA注射组。(3)构建了牙鲆CD79b重组表达载体pET3

7、0(a)一CD79b，将表达载体转化入大肠杆菌进行表达，获得了分子量大小为24．7kDa的重组蛋白。用亲和层析法纯化了CD79b蛋白并免疫Balb／C小鼠和新西兰大白兔，得到了CD79b蛋白多克隆抗体，ELISA实验结果显示，CD79b蛋白的多克隆抗体与重组表达蛋白具有结合活性且特异性较好。(4)CD79b蛋白的多克隆抗体与牙鲆外周血白细胞的免疫印迹实验显示，CD79b蛋白多克隆抗体能特异性识别牙鲆外周血白细胞一条分子量为29kDa左右的CD79b蛋白；免疫共沉淀实验显示牙鲆外周血白细胞中分子量分别为29kDa和32kD

8、a的两种蛋白被沉淀出来，其中29kDa的蛋白能够被CD79b重组蛋白的多克隆抗体所识别，推测32kDa的蛋白可能为牙鲆的CD79a蛋白；在间接免疫荧光实验中CD79b蛋白的多克隆抗体能够与牙鲆外周血中的部分自细胞特异性结合，并通过免疫双荧光染色实验分析了表面免疫球蛋白阳性(mlgM+)细胞和表面CD79b+细胞的分布