牙鲆原代肾细胞培养及其对牙鲆弹状病毒的易感性研究.pdf

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1、第48卷第1期2018年1月中国海洋大学学报PERIODICALOFOCEANUNIⅦRSITY0FCHINA48(1)：019～024Tan．，2018牙鲆原代肾细胞培养及其对牙鲆弹状病毒的易感性研究。张家林，唐小千“，绳秀珍，邢婧，战文斌(中国海洋大学水产学院水产动物病害与免疫实验室，山东青岛266003)摘要：为探索牙鲆弹状病毒(HIRRV)对敏感宿主牙鲆肾脏原代细胞的敏感性，本研究分别采用组织块移植法和胰酶消化法对牙鲆(Paralichthysoiivaceus)肾脏细胞进行分离和原代培养。研究显示，采用组织块移植法进

2、行培养后，会出现较多的成纤维样细胞，而采用胰酶消化法进行培养后，细胞呈现上皮细胞样且形态完整，7天后细胞的汇合率可达80％。采用胰酶消化法对牙鲆肾细胞进行原代培养，传代后进行病毒敏感性实验，实验表明牙鲆肾细胞接种HIRRV后，第3天出现了明显的CPE，病毒滴度达1×105。8TCIDso／mL；RT-PCR可从感染3天的细胞培养物中检测到HIRRV的特异性mR—NA；利用抗HIRRV单克隆抗体结合免疫荧光试验可从感染24h的细胞中检测到特异性荧光信号，信号分布在细胞膜和细胞质中。研究结果表明，基于胰酶消化法建立的牙鲆肾脏原代细

3、胞对HIRRV较敏感，HIRRV可成功侵染该细胞并在细胞内实现快速增殖。本研究为牙鲆弹状病毒的致病机制研究提供了材料和实验基础。关键词：牙鲆；原代细胞培养；胰酶消化法；牙鲆弹状病毒；敏感性中图法分类号：$91文献标志码；A文章编号；1672—5174(2018)01—019-06DoI：10．16441／j．cnki．hdxb．20170038引用格式：张家林，唐小千，绳秀珍，等．牙鲆原代肾细胞培养及其对牙鲆弹状病毒的易感性研究I-J]．中国海洋大学学报(自然科学版)，2018，48(1)；19-24．ZHANGJia-Lin

4、，TANGXiao—Qian，SHENGXiu-Zhen，eta1．PrimarycellcultureofJapaneseflounder(Paralichthysoli—vaceus)kidneyanddeterminationoftheirsusceptibilitytohiramerhabdovirusEJ]．PeriodicalofOceanUniversityofChina，2018，48(1)：19—24．牙鲆弹状病毒(Hiramerhabdovirus，HIRRV)是一种重要的鱼类弹状病毒，主要感染牙鲆(Par

5、alich—thysolivaceus)、香鱼(PlecoglossusaZtivelis)、石鲽(Kareiusbicoloratus)、黑鲷(Myliomacrocephalus)、茴鱼(ThymalZusthymallus)、花鲈(Lateol面ya．T．7ylacM-latus)等鱼类[15

6、，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。感染鱼的症状主要表现为鳍基充血，肌肉组织及内部器官出血，造血器官坏死，死亡率高达60％[6]。该病毒主要在中国、日本和韩国等冬季冷水区域流行，欧洲的波兰等地也有该病毒的分离报道[4]。该病毒具有

7、传染性强、死亡率高的特点，严重威胁我国鲆鲽鱼类的健康养殖。然而，目前市场上缺少有效的治疗药物和预防性疫苗。因此，亟需对该病毒的毒力特性及其致病机理等方面进行深入的研究。牙鲆隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)鲽型目(Pleuronetiformes)鲆科(Bothidea)，具有经济价值好、营养价值高的特点，迅速成为我国黄、渤海地区的主要经济性鱼类。随着集约化养殖程度的不断提高，养殖环境越来越恶劣，养殖鱼类的病害问题也日渐突出，这成为了限制我国牙鲆养殖产业发展的难题。细胞培养分离技术是病毒生物学研究中应用最为广泛的技术之

8、一，但来源于牙鲆的细胞资源较少，已知的细胞系只有牙鲆胚胎细胞系(HINAE)和牙鲆鳃细胞系(FG)[7]。然而HIRRV在这2种细胞系上的滴度较低，在H氓一RV的致病机理研究中存在一定的局限性。此外，研究表明多种弹状病毒通过血液循环扩散到全身各组织中[8]，且肾脏是鱼类的造血器官，推测肾脏可能是一种良好的细胞来源。结合国外的研究工作，本文进行了牙鲆肾脏细胞的分离、原代培养和对HIRRV的敏感性研究，为进一步研究牙鲆弹状病毒的致病机理提供细胞模型和材料。1材料与方法1．1实验用鱼与毒株健康牙鲆((20+5)g)购白日照顺源水产育

9、苗有限公司，游动正常，无临床症状。蓄养于40crn)<40cmX*基金项目：国家自然科学基金项目(31672685；31672684；3142295)；海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室开放基金项目资助SupportedbyNationalNaturalScienceFou