牙鲆变态中TRβ基因的表达及其靶向miRNA鉴定分析.pdf

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150110213上海海洋大学硕士学位论文牙鲆变态中TRβ基因的表达及其靶向题目：miRNA鉴定分析英文题目：TheexpressionofTRβgeneinParalichthysolivaceusmetamorphosisandidentificationoftargetmiRNA专业：生物学研究方向：鱼类发育生物学姓名：刘素萍指导老师：施志仪教授二O一八年五月二十三日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，

2、崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编

3、入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注罗祖玉复旦大学教授主席吴超群复旦大学教授委员张俊玲上海海洋大学副教授委员喻杰上海海洋大学博士秘书上海海洋大学硕士学位论文牙鲆变态中TRβ基因的表达及其靶向miRNA鉴定分析摘要牙鲆（Paralichthysolivaceus）主要分布在中国和日

4、本沿海地区，是我国非常重要的海水养殖鱼类。在牙鲆变态过程中，牙鲆的形态、生理方面都发生了剧烈的变化，涵盖了许多生物学变化过程。甲状腺激素（thyroidhormone，TH）通过与其受体（THreceptors,TRs）结合对牙鲆变态起着重要的调控作用。TRs存在于细胞核内，是一类能够与染色质结合在一起的蛋白质，分为α、β两种类型，高度亲和于DNA识别位点。TRs可分为不同亚型包括TRαA、TRαB和TRβ，研究表明三者在牙鲆变态期间表达升高，变态结束后恢复到较低的水平，且TRβ在变态高峰期较TRαA、TRαB有

5、更丰富的表达。因而，甲状腺激素受体尤其是TRβ在牙鲆变态中发挥着至关重要的作用。目前关于TRβ调控牙鲆变态发育的作用机制相关报道较少。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的非编码的单链RNA分子，长度大约在大小在20～25nt之间，在动物中，它们一般与其靶基因的3'-非翻译区（3'-untranslatedregion，3'-UTR）结合，从而能有效地抑制其转录产物的合成，或者导致靶向miRNA的降解产生基因沉默。那么在牙鲆变态发育过程中，miRNAs与TRβ3'-UTR之间是否存在什么联系？目前属于未

6、知。为探讨miRNAs与牙鲆TRβ-3'-UTR的作用关系，本论文根据NCBITRβ已有序列，设计3'-RACE-outer引物、I上海海洋大学硕士学位论文3'-RACE-inner引物，然后按照3'-RACE试剂盒使用说明进行操作，将扩增得到的PCR产物进行胶回收、连接、转化和克隆测序后，得到牙鲆TRβ基因的3'-UTRcDNA序列。TRβ基因全长1740bp，其中5'-UTR为115bp、CDS为1188bp、3'-UTR为437bp，编码395个氨基酸，3'-末端有poly（A）尾。进行氨基酸序列比对得出，

7、牙鲆TRβ的氨基酸序列与其他物种相比同源性在85%-99%之间，具有高度保守的配体结合区LBD和DNA结合区DBD。对TRβ基因的进化树分析显示牙鲆与石斑鱼Epinepheluscoioides（ABP62962.1）、多纹褶唇鱼Labrusbergylta（XP_020494287.1）、橙线雀Acanthochromispolyacanthus（XP_022047585.1）、雪鲷Maylandiazebra（XP_004561076.1）在进化关系上较近，以上物种均位于鱼类的分支上，因此是符合进化理论的。牙

8、鲆TRβ基因的高度保守结构域及与其它物种的高度同源性，说明其在功能上具有一定的保守性。利用Real-timePCR检测牙鲆TRβ基因的表达情况，结果显示牙鲆TRβ基因在成鱼各组织（脑、肌肉、心脏、肾脏、鳃、胃、肝脏、肠以及性腺)以及变态发育17日孵龄(dayspost-hatching,dph)至36dph时期中均有表达。TRβ在肾脏和心脏中表达量较高，而在肌肉和性腺中表