温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响.pdf

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1、中国水产科学2011年11月，18(6)：1377—1383JournalofFisherySciencesofChina研究论文DoI：10．3724／SP．J．1118．2011．01377温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响许国晶，绳秀珍，战文斌中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室山东青岛266003摘要：在9~C、15℃、21℃和26*C4种不同水温下，用淋巴囊肿病毒(LCDV)灭活疫苗腹腔注射牙鲆，应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)研究了其皮肤黏液中特异性抗体水平的变化，以分析温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响。ELISA结果表明，9℃和15℃水温下牙鲆黏液OD值分别在注射LCD

2、V后第9周和第7周达到峰值(9℃：OD=0．179；15℃：OD=0．233)；21℃水温下OD值上升最快，5周达到峰值(0．316)；26℃水温下OD值较21℃无显著差异，也于5周达到峰值(0．295)。采用硫酸铵分步盐析等技术粗提不同温度下OD值最高时的牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig)，SDS．PAGE检测发现，各温度组黏液蛋白中均含有72kD和26kD蛋白条带。Westernblotting结果显示，抗牙鲆血清Ig重链的单克隆抗体只与黏液蛋白中72kD条带发生反应，确定为牙鲆皮肤黏液Ig重链。综上结果表明，牙鲆在最适生活温度(21℃)下，抗体应答强度最大。牙鲆粗提黏液蛋白中Ig的

3、初步确定，为探索牙鲆黏液免疫机制提供了材料。关键词：牙鲆；皮肤黏液抗体；免疫球蛋白；温度；淋巴囊肿病毒中图分类号：$941文献标志码：A文章编号：1005—8737一(2011)06—1377—07覆盖在鱼体皮肤、鳃和胃肠道等表面的黏膜种之一，目前尚未发现温度对牙鲆皮肤黏液免疫组织及其分泌的黏液，构成了鱼类的黏膜免疫系影响的研究。本研究分离淋巴囊肿病毒(LCDV)统，是鱼体抵抗病原入侵的第一道防线]。鱼类并制成灭活疫苗，腹腔注射在不同水温下养殖的黏膜组织中分布有各种免疫细胞，使其具有独立牙鲆，应用间接ELISA研究了其皮肤黏液中特异完成局部免疫应答的功能。目前已从虹鳟(Oncorh—性抗

4、体的动态变化；生化方法提取牙鲆黏液免疫ynchsmykiss)及鲇f，c，rpunctatus)等多种鱼类球蛋白粗品，通过SDS—PAGE和Westernblotting皮肤黏液中发现了免疫球蛋白(Ig)，可以对病原比较了温度引起的牙鲆黏液中蛋白条带的变化，体的入侵发生特异性的免疫应答[4]。并初步验证了牙鲆黏液中的免疫球蛋白，为探索鱼类作为变温动物，体温直接依赖于周围环牙鲆黏液免疫机制提供了材料及理论依据。境的温度，其免疫机能，如T细胞和B细胞的相1材料与方法互作用、抗体的合成和释放等受水温的影响极大，低温能够完全或部分抑制抗体生成，而升高温度1．1实验材料能加速抗体的合成[6-71。

5、前人的研究大都集中在温患病牙鲆采自山东威海某养殖场，病鱼体表度对鱼类系统免疫方面的影响[8]，对其黏液免疫可见有单个或聚集成团的乳头瘤状赘生物。70％影响的研究较少。牙鲆(Paralichthysolivaceus)作酒精棉球消毒患病部位后，用灭菌手术刀片切下为中国传统的名贵商品鱼和出口创汇重要养殖品囊肿物，一80℃下分装保存备用。收稿日期：2011-04—06；修订日期：2011-05—19．基金项目：国家自然科学基金资助项目(31172429，31072232)．作者简介：许国晶(1984一)，女，博士，主要从事水产动物病害与免疫学研究．E-mail：guojingxul8@yaho

6、o．tom．ca通信作者：绳秀珍，副教授．E-mail：xzsheng@OUC．edu．cn1378中国水产科学第l8卷实验牙鲆取自山东日照牙鲆鱼养殖基地，平h，PBST洗3次后滴加1：4000稀释的羊抗鼠Ig均体长15cm；把鱼随机分为4组，每组80尾，饲碱性磷酸酶标记抗体100p．L，37~C反应1h，洗涤养于200cmx100cmx50cm容积的玻璃钢水槽后加0．1％(w／v)pNPP(pNPP缓冲液稀释)，室温中，水温(18士1)℃，充气，每天换水1／3，投喂饵显色30min，405nm波长测定平均吸光值(OD)。料2次，暂养7天后，采用空调缓慢调整水温降至骨髓瘤细胞培养上清代替

7、单克隆抗体2D8作为阴9~C，另外3组采用加热棒，分别缓慢调整水温升性对照。至15℃、21℃和26℃。1．5牙鲆皮肤黏液中抗体的粗提抗牙鲆血清Ig重链的单克隆抗体(2D8)~1本参照陈壶lJ初步纯化鲫鱼皮肤黏液IgM的方实验室制备J。法，并适当修改，采用30％、50％饱和硫酸铵分步1．2牙鲆淋巴囊肿病毒提纯盐析粗提牙鲆黏液Ig。根据实验中不同温度组黏参照Cheng[]的方法从牙鲆体表囊肿物中提液抗体OD值达到峰值的时间，分别取免疫纯