缺氧在卵巢癌血管生成拟态的形成中作用的研究

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1、天津医科大学博士学位论文中文捅姜卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤首位，预后差。血管生成拟态(vasculogenicmimicry,VM)是大多数高度恶性肿瘤组织内普遍存在的一种功能性微循环形式，指具有可塑性的肿瘤细胞在没有内皮细胞参与的情况下，通过基质重塑和自身变形形成的微循环管道。血管生成拟态的存在也使传统的肿瘤抗血管治疗难以彻底阻断肿瘤血供，无法有效改善患者的生存率。VM是是肿瘤可塑性的一种表现，目前关于其诱导肿瘤细胞可塑性出现的分子机制仍不清楚。缺氧是肿瘤血管生成的主要诱导因素，且

2、缺氧微环境普遍存在于快速增殖的实性肿瘤内，因而我们考虑缺氧也极可能是诱导肿瘤细胞可塑性，形成VM的重要因素之一。目的本研究旨在探讨缺氧微环境在肿瘤血管生成拟态形成中的作用，及缺氧促进肿瘤细胞形成VM的可能的分子机制。探究缺氧微环境下肿瘤细胞形成VM的分子机制有助于完善和发展VM理论；这对丰富肿瘤血管生成理论的研究具有重要意义，同时对临床抗肿瘤治疗提供了靶点。方法1)首先对前期实验中收集的来自天津医科大学附属肿瘤医院7l例经手术切除且随访资料完整的卵巢癌临床标本进行HIF．10c、EMT表征蛋白E．cadherin、

3、vimentin及EMT调控蛋白Twistl、Snail、Slug及血管内皮相关蛋白VE．cadherin、FLT-1、FLK．1的免疫组织化学染色。重点观察HIF．1a与E．cadhefin、vimentin及VM在同～例卵巢癌标本的连续性组织切片上的表达定位之间的关系。2)构建体外三维培养模型，观察是否缺氧微环境促进了VM的形成。细胞功能学实验方法探究缺氧与肿瘤细胞的迁移、侵袭和三维管道化形成能力之间的关系。3)应用RT-PCR、WestemBlot、免疫荧光实验从蛋白和mRNA水平检测E．cadherin，v

4、imentin在缺氧与常氧环境下的表达情况，探究是否缺氧诱导肿天津医科大学博士学位论文瘤细胞发生了EMT,从而促进VM的形成。4)WesternBlot检测VM形成关键蛋白VE．cadherin在常氧环境和缺氧环境下表达的差异。5)明胶酶谱法分析缺氧对基质金属蛋白酶MMP．2和MMP．9活性的影响。勿七甲：口7K1)HIF．1a蛋白与血管生成拟态的形成有关71例卵巢癌中HIF．1a的阳性表达率为39．44％(28／71)。VM阳性组HIF．1a的阳性表达率为61．11％(11／18)；VM阴性组HIF．1a的阳性表

5、达率为32．08％(17／53)。HIF．10【在VM阴性组和VM阳性组阳性表达率的差别具有统计学意义。HIF．10【蛋白定位于卵巢癌细胞的胞核内，呈棕黄色颗粒。HIF．10【阳性细胞簇在肿瘤浸润边缘、坏死区及新生血管的周围最为密集。2)体外三维培养证实缺氧促进了卵巢癌细胞血管生成拟态的形成，并增强了卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力。Matrigel三维培养模型上发现与常氧组相比，缺氧组卵巢癌细胞形成VM的时间较早，结构较复杂。OVCAR3主要形成管状型血管生成拟态，SKOV3主要形成基质型血管生成拟态。Transwel

6、l小室体外侵袭实验发现给予CoCl2缺氧处理24小时后，与常氧组相比，缺氧组穿膜细胞数增多，统计结果显示差别具有统计学意义。迁移实验发现给予CoCl2缺氧处理24小时后，与常氧组相比，缺氧组迁移细胞数较多，差别具有统计学意义。缺氧处理48小时后卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞MMP．2活性比常氧状态高，进一步证明缺氧情况下卵巢癌的侵袭性增强。3)缺氧诱导EMT发生，是血管生成拟态形成的内在机制在同一例标本的连续性组织切片上分析VM阳性组与阴性组中HIF．1a与E．cadherin，vimentin的表达定位之间的

7、关系，发现在61％(11／18)VM阳性组HIF．10【高表达时，vimentin也同时高表达，而E．cadherin低表达。而VM阴性组不存在这种对应关系，即在VM阴性组HIF．1Oc高表达时，没发现这种对应关系的存在。且Twistl、Slug蛋白在VM阴性组和VM阳性组阳性表达率间的差别具有统计学意义，VM阳性组表达较高。表明缺氧、EMT及VM三者间存在密切关系。体外实验证实SKOV3、OVCAR3细胞在CoCl2缺氧48小时细胞均出现11天津医科大学博士学位论文明显EMT样形态变化，转变成纤维母细胞样形态，出

8、现多角伪足，细胞之间的粘附性降低，细胞核呈现团块状或固缩状结构。细胞免疫荧光、Westemblot及RT-PCR检测常氧环境下和缺氧环境下细胞的蛋白和mRNA表达证实缺氧环境下卵巢癌细胞SKOV3、OVCAR3中vimentin蛋白及mRNA水平均上调表达，E．cadherin表达显著下调。以上结果进一步证实缺氧微环境下卵巢癌细胞通过发生EMT样可塑性转变，