bcl-2twist1蛋白互作在缺氧促进肝癌血管生成拟态形成中的作用

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1、分类号：R361学校代码：10062密级：学号：2013601039博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：Bcl-2/Twist1蛋白互作在缺氧促进肝癌血管生成拟态形成中的作用TITLETheroleofBcl-2/Twist1proteincooperationinhypoxia-inducedvasculogenicmimicryformationinhepatocellularcarcinoma一级学科：基础医学二级学科：病理学与病理生理学论文作者：刘坤指导教师：孙保存教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月分

2、类号：R361学校代码：10062密级：学号：2013601039学位类别：科学学位☑专业学位学科门类：医学博士学位论文DOCTORALDISSERTATION论文题目：Bcl-2/Twist1蛋白互作在缺氧促进肝癌血管生成拟态形成中的作用TITLETheroleofBcl-2/Twist1proteincooperationinhypoxia-inducedvasculogenicmimicryformationinhepatocellularcarcinoma一级学科：基础医学二级学科：病理学与病理生理学论文作者：刘坤指导教师：孙保

3、存教授导师组成员：赵秀兰主任技师张丹芳副教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外,、论文中不一包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名:0弘砷日期:∞`年‘月r日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进

4、行检索,并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文,并编入有关数据库。保密匚彐,在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密压Z。“’(请在相对应的方框内打V’)学位论文作者签名:日期:'l,年6月少日导师签名:日期:冫ls年6月r日天津医科大学博士学位论文中文摘要研究目的缺氧是实体肿瘤微环境的重要特征之一，当肿瘤体积生长至1mm3时，其内部一般都会有相当数量的肿瘤细胞处于缺氧状态。肿瘤可通过多种血管生成方式来缓解自身的缺氧状态。血管生成拟态（vasculogenicmimicry,VM）是

5、由恶性肿瘤细胞形成的一种特殊的血液供应模式，其管道的管壁完全由肿瘤细胞而非内皮细胞构成，管腔内含有红细胞，周围没有坏死或炎症浸润。缺氧可以促进肝细胞肝癌VM的形成。本实验室前期研究表明缺氧可以促进Bcl-2蛋白和Twist1蛋白相互结合、作用，最终促进VM的形成，但其具体机制尚不明确。本研究拟探讨缺氧情况下Bcl-2蛋白与Twist1蛋白互作促进VM的机制。研究方法1、比较不同肝细胞肝癌细胞系的Bcl-2、Twist1表达情况，筛选出HepG2细胞系和Bel7402细胞系。HepG2细胞系高表达Bcl-2蛋白，低表达Twist1蛋白，Be

6、l7402细胞系与之相反，低表达Bcl-2蛋白，高表达Twist1蛋白。2、应用氯化钴对体外培养的肝癌细胞系进行缺氧，应用westernblot、免疫荧光观察缺氧后Bcl-2和Twist1蛋白表达的变化，并应用胶上三维培养观察缺氧前后细胞成管道能力的变化。3、运用质粒转染方法筛选出稳定过表达Twist1和Bcl-2蛋白的HepG2细胞和Bel7402细胞，westernblot、免疫荧光验证转染效果并用westernblot检测转染后上皮间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）标记蛋白（E-c

7、adherin、vimentin），干性标记蛋白（Bmi1、CD44、Oct4）和内皮相关蛋白（VE-cadherin、FLT1、KDR）的表达情况。4、运用划痕实验、侵袭实验、MTT、平板克隆形成实验及三维培养实验检测Bcl-2、Twist1共过表达对肝癌细胞系迁移、侵袭、增殖、克隆形成能力及管道形成能力的影响。5、使用siRNA建立稳定降表达Bcl-2的HepG2细胞系和稳定降表达Twist1的Bel7402细胞系，破坏Bcl-2/Twist1蛋白互作。将对照组细胞和降表达组细胞同时进行缺氧，观察不同组别的细胞在缺氧0h，12h，24

8、h，36h，48h，60h时Bcl-2，Twist1，EMT标记蛋白，干性标记蛋白和内皮相关蛋白的表达变化。I天津医科大学博士学位论文6、建立裸鼠右后肢缺氧模型，左后肢作为正常对照。将HepG