晚期糖基化终产物介导血管内皮细胞内质网应激及其机制

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文晚期糖基化终产物介导血管内皮细胞内质网应激及其机制MechanismofAdvancedGlycationEndProducts—InducedEndoplasmicReticulumStressinEndothelialcells课题来源：国家自然科学基金面上项目(30771028)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院吴丽丽黄巧冰教授病理学与病理生理学学术型硕士基础医学院2013年05月20日广州硕士学位论文晚期糖基化终产物介导血管内皮细胞内质网应激及其机制硕士研究生：吴丽丽指导教师：黄巧冰摘要蛋白质赖氨酸的氨基和还原糖的醛基之间发生非酶

2、性糖基化反应，形成Schif蹴，经Amadori反应重排后形成相对稳定的晚期糖基化终产物(advancedglycationendproducts，AGEs)。在糖尿病血管并发症的发生过程中，AGEs大量堆积是导致糖尿病内皮细胞损伤的重要原因。AGEs可通过介导细胞外相邻的无关蛋白质互相交联等直接效应，改变被修饰蛋白的结构和功能；AGEs也可以与特异的AGEs受体结合影响胞内信号转导、刺激细胞因子释放、引起细胞的氧化应激等，在糖尿病血管并发症中发挥致病效应。真核细胞的内质网是蛋白质折叠与成熟、脂质生物合成以及Ca2+储存的重要场所。生理状态下的蛋白折叠需求增加或出现了打乱蛋白折叠的刺激因

3、素，都可能使内质网功能超负荷运转，从而导致未折叠或错误折叠蛋白蓄积，出现内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERstress)。为了防止未折叠或错误折叠蛋白蓄积，真核细胞则引发非折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse，UPR)，改变细胞的转录和翻译程序，以处理这些蛋白同时改善内质网的应激状态。如果应激时间过长，将不可避免地引起细胞凋亡，这是多种心血管疾病、特别是肥胖和胰岛素抵抗型(2型)糖尿病发病的重要机制。静息状态时，内质网应激的三种感应分子，包括蛋白激酶R样内质网激酶摘要(proteinkinaseR-likeERkinase，PE

4、RK)、ER转膜蛋白激酶la(inositol—requiringla，IREla)和转录激活因子6(activatingtranscriptionfactor6，ATF6)，与内质网分子伴侣蛋白一葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78)结合处于非激活状态。内质网应激时，GRP78与这些感应分子解离，以处理未折叠或错误折叠的蛋白，而解离后的感应分子则被激活，启动从内质网到细胞核的信号级联放大效应，引发UPR。目的：本研究旨在阐明AGEs是否导致血管内皮细胞的内质网应激，并探讨其介导内质网应激的细胞信号转导机制，特别是氧化应激在其中发挥的作用。方

5、法：本课题以人脐静脉内皮细胞株HUVEC为研究对象，应用细胞培养、蛋白免疫印记、siRNA干扰、细胞免疫荧光等方法，观察AGEs刺激下内质网标志性蛋白表达和磷酸化水平的变化及其介导内皮细胞内质网应激的后果，并从氧化应激角度探讨AGEs介导内质网应激的信号通路机制。AGE修饰的牛血清白蛋白(AGE—modifiedbovineserumalbuminAGE．BSA)，由牛血清白蛋白与D．葡萄糖共孵育8周制得。体外培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC，接种于3．5cm细胞培养皿上，待细胞长至融合或接近融合时，换无血清培养基继续培养24h，使细胞获得同步生长，然后按实验分组分别处理备用。用蛋白免疫

6、印迹技术检测GRP78的表达和IREla的磷酸化水平变化；应用IRElasiRNA干扰IREla的表达，用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察NF．KB在细胞内的分布改变，同时用蛋白免疫印迹技术检测细胞核内NF．r,B的表达变化；将脐静脉内皮细胞培养至密度为60～80％，予NADPH氧化酶(Nox)亚型Nox4的siRNA转染细胞48h。另给予活性氧的抑制剂谷胱甘肽(GSH)15mmol／L预处理细胞1h，用蛋白免疫印迹技术检测AGEs刺激后内皮细胞的内质网应激标志性蛋白GRP78的表达和IRElot的磷酸化水平变化。应用Nox4siRNA干扰Nox4蛋白的表达，用免疫荧光染色法、激光共

7、聚焦显微镜观察NF．rd3在细胞内的分布改变。用化学发光法显示蛋白条带，以ImageJ软件分析各组灰度值。TGTT硕士学位论文作为内质网应激的阳性对照。结果：1．AGE．BSA诱导人脐静脉内皮细胞内质网应激标志性蛋白表达和活性的增高(1)AGE．BSA以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞GRP78表达的增高结果显示，AGE．BSA刺激可引起GRP78表达显著增加，且呈时间(F=46．609，P=0．000)和剂量(F=10．265，P