MicroRNA-107抑制非小细胞肺癌生长和转移生物学机制

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1、1BiologicalmechanismofMicroRNA-107onInhibitionofnon-smallcelllungcancergrowthandmetastasisADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByHouxinSupervisor:ProfessorqiyingJiangJune.20173I摘

2、要背景：microRNAs（miRNAs）是一类参与基因表达和蛋白转录的非编码微小RNAs，目前，肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中NSCLC约占肺恶性肿瘤的的85％。在中国的过去的五十年，NSCLC的患病率增长迅速。尽管在NSCLC患者在外科治疗中有相当大的进展，但是NSCLC的预后仍然不令人满意，并且NSCLC患者的5年生存率<16％。肿瘤出现远处转移是常见的，这是NSCLC在临床治疗失败的主要原因，主要体现在5年生存率很低。因此，迫切需要找到参与NSCLC转移的潜在分子机制，这可能有助于寻找新的诊断标志物和新的NS

3、CLC的治疗靶标。微小RNA（miRNA）是大小约为22个核苷酸的小的编码RNA，其通过结合3'-非翻译区（3'-UTR）负调节mRNA稳定性和抑制mRNA的翻译。miRNA已被报道在广泛的细胞过程中发挥关键作用，包括增殖，循环，分化，凋亡和转移。miRNAs在许多癌症中失调，并且涉及各种癌症类型的起始和进展，并且基于调节的肿瘤形式和它们的靶基因作为oncomiR或肿瘤抑制miRNA起作用。对于NSCLC，已经鉴定出许多miRNA参与NSCLC生长和转移，并且可以作为NSCLC的有效治疗靶标或诊断标志物。研究显示在几种类型的癌

4、症例如胶质瘤，乳腺癌，胃癌，宫颈癌和肾透明细胞癌，位于染色体10上的微小RNA-107（miR-107）表达水平下降。以前的研究表明miR-107的表达在NSCLC组织中降低，并且miR-107的过表达能够诱导人NSCLC细胞系中的细胞周期停滞，并且增加A549非小细胞肺癌的顺铂化学敏感性。然而，它的生物作用，特别是关于侵袭和转移，尚未在NSCLC中彻底验证。目的：目前虽然在NSCLC患者中已经发现微小RNA-107（miR-107）的异常表达。然而，很少知道其在NSCLC进展和转移中的作用和分子机制。本研究的目的是了解miR

5、-107的分子机制及其在NSCLC进展和转移中的潜在作用。方法：1、首先应用qRT-PCR技术并检查了四种NSCLC细胞系（A549，H1299，SPCA1和H358）和正常肺细胞系（BEAS-2B）中的miR-107表达。再进一步在临床样本中验证，在临床相关研究中收集经手术后病理证实的NSCLC标本30例，通RT-PCRI检测miR-107在NSCLC癌组织、癌旁正常肺组织中的表达水平是否存在差异。统计学分析miR-107表达水平与NSCLC患者TNM分期的关系。2、体外细胞实验,利用qRT-PCR检测miR-107的表达水

6、平，筛选出具有代表特异性的细胞。MiR-107转染A549细胞，应用qRT-PCR验证转染效率；细胞增值测试、CCK-8试验、集落形成检测、细胞侵袭检测miR-107对NSCLC细胞的生长、侵袭、转移等的影响；流式细胞实验分析A549细胞周期。体内裸鼠成瘤实验验证miR-107抑制NSCLC在体内的生长。3、进一步对miR-107抑制NSCLC靶基因以及分子机制的研究。使用三个生物信息数据库（TargetScan，miRanda和PicTar）预测miR-107的潜在靶标，基于在BDNF的299-305bp的推定靶序列选择BD

7、NF作为miR-107的靶基因。为了验证BDNF是否是miR-107在NSCLC细胞中的直接靶标，将含有miR-107结合位点或突变位点的人BDNF3'UTR片段克隆到pGL3载体中，并将miR-107mimic和miR-NC共转染A549细胞并培养48小时，然后测量荧光素酶活性。进一步对miR-107抑制NSCLC的靶基因及分子机制进行研究。BDNF的上调有效逆转miR-107对NSCLC增殖，转移和侵袭的抑制肿瘤功能。miR-107上调或BDNF的低表达能够抑制PI3K/AKT信号传导通路的活化。结果：1、应用RT-PCR

8、技术并检查了四种NSCLC细胞系（A549，H1299，SPCA1和H358）和正常肺细胞系（BEAS-2B）中的miR-107表达，与正常肺细胞系相比，miR-107在所有NSCLC细胞系中异常下调（P<0.05）。临床非小细胞肺癌标本中，发现miR-107表达的减少与淋巴