沉默XRCC4基因表达对三阴性乳腺癌放射治疗敏感性的影响

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1、单位代码10475学号104753140965分类号R6硕士学位论文沉默XRCC4基因表达对三阴性乳腺癌放射治疗敏感性的影响学科、专业：临床医学、外科学研究方向：乳腺恶性肿瘤申请学位类别：医学硕士申请人：温玉清指导教师：傅侃达副教授左曙光教授二〇一七年六月SilencingofXRCC4expressionwithshRNAincreasedRadiosensitivityofTriple-negativeBreastCancerCellsADissertationSubmittedtotheGraduateSc

2、hoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByYuQingWenSupervisor:Prof.KanDaFu；Prof.ShuGuangZuoJune,2017摘要背景：三阴性乳腺癌(TripleNegativeBreastCancer,TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)均为阴性的乳腺癌。虽然TNBC对放、化疗较为敏感，但是其

3、对传统的内分泌治疗及针对Her2的靶向治疗不敏感，因此其远期治疗效果不佳，预后较差。放射治疗是TNBC治疗的重要组成部分，是重要的局部治疗手段之一，但是其本身存在强烈的毒副作用。放射剂量较小，不能达到很好的杀伤肿瘤细胞的效果；放射剂量较大，则可能会引起严重的并发症，如皮肤损伤，敏感组织（如骨髓、睾丸、卵巢等）的功能减退甚至丧失；严重的放射损伤，可能会有放射性截瘫、脑坏死等极为严重的并发症。因此，探索如何提高TNBC对放射的敏感性十分必要和迫切，从而实现以更小的放射剂量达到治疗TNBC的目的，减少治疗过程中的并发症

4、。X线修复交叉互补基因4（X-rayrepaircrosscomplementingprotein4,XRCC4）是DNA双链断裂修复途径NHEJ中非常重要的一员。该基因表达的蛋白可以与连接酶IV相互作用形成复合体，对DNA断裂进行修复，从而维持基因组的稳定性和完整性。XRCC4的功能缺失，会导致DNA修复途径出现差错，导致DNA损伤的肿瘤细胞死亡。有研究显示，在接受放射治疗的食管癌患者中，XRCC4的低表达患者比XRCC4高表达患者具有更长的生存时间，提示XRCC4的低表达与放疗敏感性增加可能有一定的关系。国内

5、有学者报道，在TNBC中，XRCC4的表达阳性率显著低于癌旁组织，但是与生存期没有相关性。目前关于XRCC4的表达水平与TNBC放疗敏感性研究，国内外鲜有报道。目的：探索沉默XRCC4基因表达，是否可以增加三阴性乳腺癌对放射治疗的敏感性。方法：利用分子克隆及RNA干扰技术，建立XRCC4基因沉默的TNBC稳定细胞系；利用MTT比色法检测XRCC4沉默对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞增殖的影响。克隆集落形成实验检测XRCC4基因沉默对MDA-MB-231克隆形成能力的影响；进一步的，以不同放射剂量（

6、2Gy、4Gy、6Gy）分别对未感染、空载体感染细胞和XRCC4沉默TNBC细胞系进行处理，克隆集落形成实验检测沉默XRCC4基因表达对IMDA-MB-231放疗敏感性的影响。结果：1.XRCC4在三阴性乳腺癌组织中的表达阳性率为34.38%，在癌旁组织中的表达阳性率为62.50%，两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。2.成功构建同时携带绿色荧光蛋白和嘌呤霉素基因的shRNA慢病毒表达载体pLenti-U6-EF1a-copGFP-P2A-Puro。3.利用上述构建好的载体，成功构建表达XRCC4-shRN

7、A的慢病毒载体pLenti-U6-XRCC4-EF1a-copGFP-P2A-Puro，包装慢病毒后，成功建立了稳定沉默XRCC4基因的三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231-XRCC4-和MDA-MB-468-XRCC4-。4.MTT实验结果显示，未感染、空载体感染和XRCC4-shRNA感染的MDA-MB-231细胞的增殖倍数差异无统计学意义（均为P>0.05），在各时间点（24h、48h、72h），三个细胞间的增殖倍数差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与未感染和空载体感染细胞比较，XRCC4-shRNA

8、感染的MDA-MB-468细胞的增殖倍数差异无统计学意义（均为P>0.05），在各时间点（24h、48h、72h），三个细胞间的增殖倍数差异均无统计学意义（均为P>0.05）；5.克隆形成实验结果显示，未采用放射辐照时，XRCC4-shRNA感染的MDA-MB-231细胞的克隆集落数目与未感染和空载体感染细胞比较，差异无统计学意义（P>0.05）；但是XRCC4-shRN