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时间:2018-11-17
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1、RNAi沉默EGFR基因对卵巢癌放疗敏感性的影响作者:林远洪吴永忠李少林郭启帅罗茜【摘要】目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌放疗敏感性的增强作用。方法构建针对EGFR基因序列特异性短发夹状RNA(shRNA)表达载体,应用卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组、单纯放疗组、基因放疗组,采用6MVX线照射裸鼠瘤组织,监测瘤体积,测量瘤质量,取瘤组织行RTPCR、algrooranimalmodelicelydividedintocontrol,radiotherapyandgeneradiothera
2、pygroups.Theovariancancertissueorvolumeandtumoreasured.RTPCR,munohistochemistryandelectronmicroscopyongthreegroupsintumorvolume(P<0.01).Theinhibitingtumorrateoftheradiotherapyandthegeneradiotherapygroupsorcellapoptosis,necrosisprovetheradiosensitivityofovariancan
3、cer. 【Keyine2000购自Invitrogene公司;去内毒素质粒提取试剂购自Omega公司;鼠抗EGFR单克隆抗体购自SantaCruz公司;蛋白提取试剂盒购自赛百盛公司;免疫组化试剂盒及SDSPAGE凝胶购自博士德公司;总RNA提取试剂购自华舜公司;RTPCR试剂盒购自宝生公司。 1.2方法 1.2.1靶向EGFR基因shRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGenesil的多克隆位点特点,选择EGFR家族同源性基因片段(TGGGGTCGTCAAAGACGTT)为模板,利用美国Dharmaco
4、n公司siRNA设计软件,获得靶向EGFR基因序列特异性shRNA的质粒载体(pGenesilEGFR):正义链:5′UGGGGUCGUCAAAGACGUU3′;反义链:5′ACCCCAGCAGUUU CUGCAA3′;以此序列为基础,中间加入CUAUGGACA茎环序列将其分隔为反向重复序列,两端加上BamHⅠ和HindⅢ酶切位点,送武汉晶赛生物工程公司合成。 1.2.2建立卵巢癌移植瘤模型采用常规培养细胞种植法,取对数生长期的SKOV3细胞,制成4×107个/ml的细胞悬液,取0.3ml接种于每只BALB/C裸鼠右肩胛皮
5、下,观察肿瘤生长情况。3m3,a.b.c分别为肿瘤结节的长度、宽度、高度。放疗后处死裸鼠,测量瘤块质量,计算抑瘤率,抑瘤率(%)=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。 1.2.4RTPCR检测EGFRmRNA的表达分别取3组瘤组织各40mg,提取总RNA,取定量好的RNA5μl,合成cDNA,再通过PCR扩增,EGFR引物序列:P1(上游)5′AGGAGTGCGTGGAGGAAT3′、P2(下游)5′CTGCCGTCGCTTGATGAG3′,扩增产物为425bp;同时选取GAPDH作为内参照,GADPH
6、引物序列:P1(上游)5′AGGTCCACCACTGACACGTT3′、P2(下游)5′GCCTCAAGATCATCAGCAAT3′,扩增产物大小约310bp。(PCR反应参数:94℃30s,60℃30s,72℃1min,30个循环,1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳检测)。目的条带采用凝胶成像分析系统测定各条带的灰度值,以EGFR与GAPDH条带灰度值的比值作为EGFRmRNA的相对表达水平,EGFRmRNA表达抑制率(%)=(1-实验组EGFRmRNA相对表达水平/对照组EGFRmRNA相对表达水平)×100%。 1.2.5o
7、lCells,2005;9(1):115. 3TomariY,ZamorePD.Perspective:machinesforRNAi〔J〕.GenesDev,2005;19(5):51729. 4PaddisonPJ,CandyAA,BemstEinE,etal.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequencespecificsilencinginmammaliancells〔J〕.GenesDev,2002;16:94858. 5NielsenJS,JakobsenE,HolundB,eta
8、l.Prognosticsignificanceofp53,Her2,andEGFRoverexpressioninborderlineandepithelialovariancancer〔J〕.IntJGynecol
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