rnai沉默egfr基因对卵巢癌放疗敏感性的影响

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1、RNAi沉默EGFR基因对卵巢癌放疗敏感性的影响作者：林远洪吴永忠李少林郭启帅罗茜【摘要】目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌放疗敏感性的增强作用。方法构建针对EGFR基因序列特异性短发夹状RNA(shRNA)表达载体，应用卵巢癌SKOV3细胞建立裸鼠移植瘤模型，随机分为对照组、单纯放疗组、基因放疗组，采用6MVX线照射裸鼠瘤组织，监测瘤体积，测量瘤质量，取瘤组织行RTPCR、algrooranimalmodelicelydividedintocontrol,radiotherapyandgeneradiothera

2、pygroups.Theovariancancertissueorvolumeandtumoreasured.RTPCR,munohistochemistryandelectronmicroscopyongthreegroupsintumorvolume(P<0.01).Theinhibitingtumorrateoftheradiotherapyandthegeneradiotherapygroupsorcellapoptosis,necrosisprovetheradiosensitivityofovariancan

3、cer.　　【Keyine2000购自Invitrogene公司;去内毒素质粒提取试剂购自Omega公司;鼠抗EGFR单克隆抗体购自SantaCruz公司;蛋白提取试剂盒购自赛百盛公司;免疫组化试剂盒及SDSPAGE凝胶购自博士德公司;总RNA提取试剂购自华舜公司;RTPCR试剂盒购自宝生公司。　　1.2方法　　1.2.1靶向EGFR基因shRNA表达载体的构建根据siRNA的设计原则及质粒载体pGenesil的多克隆位点特点，选择EGFR家族同源性基因片段(TGGGGTCGTCAAAGACGTT)为模板，利用美国Dharmaco

4、n公司siRNA设计软件，获得靶向EGFR基因序列特异性shRNA的质粒载体(pGenesilEGFR)：正义链：5′UGGGGUCGUCAAAGACGUU3′;反义链：5′ACCCCAGCAGUUU　　CUGCAA3′;以此序列为基础,中间加入CUAUGGACA茎环序列将其分隔为反向重复序列，两端加上BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，送武汉晶赛生物工程公司合成。　　1.2.2建立卵巢癌移植瘤模型采用常规培养细胞种植法，取对数生长期的SKOV3细胞，制成4×107个/ml的细胞悬液，取0.3ml接种于每只BALB/C裸鼠右肩胛皮

5、下，观察肿瘤生长情况。3m3，a.b.c分别为肿瘤结节的长度、宽度、高度。放疗后处死裸鼠，测量瘤块质量，计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(对照组瘤质量-实验组瘤质量)/对照组瘤质量×100%。　　1.2.4RTPCR检测EGFRmRNA的表达分别取3组瘤组织各40mg，提取总RNA，取定量好的RNA5μl，合成cDNA，再通过PCR扩增，EGFR引物序列：P1(上游)5′AGGAGTGCGTGGAGGAAT3′、P2(下游)5′CTGCCGTCGCTTGATGAG3′，扩增产物为425bp;同时选取GAPDH作为内参照，GADPH

6、引物序列：P1(上游)5′AGGTCCACCACTGACACGTT3′、P2(下游)5′GCCTCAAGATCATCAGCAAT3′,扩增产物大小约310bp。(PCR反应参数：94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环，1.5%TAE琼脂糖凝胶电泳检测)。目的条带采用凝胶成像分析系统测定各条带的灰度值，以EGFR与GAPDH条带灰度值的比值作为EGFRmRNA的相对表达水平，EGFRmRNA表达抑制率(%)=(1-实验组EGFRmRNA相对表达水平/对照组EGFRmRNA相对表达水平)×100%。　　1.2.5o

7、lCells,2005;9(1):115.　　3TomariY，ZamorePD.Perspective：machinesforRNAi〔J〕.GenesDev,2005;19(5):51729.　　4PaddisonPJ，CandyAA,BemstEinE,etal.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequencespecificsilencinginmammaliancells〔J〕.GenesDev,2002;16:94858.　　5NielsenJS，JakobsenE，HolundB,eta

8、l.Prognosticsignificanceofp53,Her2,andEGFRoverexpressioninborderlineandepithelialovariancancer〔J〕.IntJGynecol