rna干扰egfr基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影

《rna干扰egfr基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞化疗敏感性的影【摘要】目的构建表皮生长因子受体(EGFR)基因的小干扰RNA（siRNA）质粒，转染人卵巢癌细胞株skov3后检测RNA干扰（RNAi）对EGFR基因表达及细胞对化疗药物敏感性的影响。方法体外构建EGFR小发卡状RNA（shRNA）的表达质粒，脂质体法介导将其转染入skov3细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测EGFRmRNA的表达，使用免疫细胞化学法(ICC)检测EGFR蛋白的表达。使用四甲基偶氮

2、唑蓝法（MTT）测定EGFRshRNA转染skov3细胞后细胞对顺铂敏感性的改变。结果EGFRshRNA转染组细胞EGFRmRNA的表达与其他两组相比明显减弱（F=87.73，q=16.81、15.33,P<0.01）,EGFR蛋白表达明显下调（F=69.29，q=14.71、13.57，P<0.01）；顺铂敏感性比正常对照组提高了约3倍。结论靶向EGFR基因的序列特异性shRNA可有效抑制skov3细胞中EGFR基因的表达，增强skov3细胞对顺铂的敏感性。【关键词】卵巢肿瘤;受体,表皮生长因子

3、;RNA干扰;顺铂　　［ABSTRACT］ObjectiveToconstructexpressionvectorofEGFRspecificsiRNAandtransfectitintohumanovariancancercelllineskov3andtheninvestigatetheeffectofRNAinterference(RNAi)onthetargetgeneexpressionandchemosensitivityofthecellline.MethodsEGFRshRNAalcontro

4、lcelllineandnonspecifictransfectantcelllinemunocytochemistryedtodetecttheinhibitiveeffectofRNAionmRNAlevelandproteinlevel,respectively.Thechemosensitivitytocisplatinethod.ResultsTheexpressionofEGFRmRNAofsequencespecificshRNAtargetingEGFRehappenedtotheprote

5、inexpression(F=69.29；q=14.71,13.57；P<0.01),osensitivitytocisplatines.ConclusionTheEGFRspecificshRNAexpressionvectorcaneffectivelysuppresstheexpressionlevelofEGFRgeneofskov3cells,andincreasesitschemosensitivitytocisplatin.［KEYidiprepSystem试剂盒的步骤提取并纯化质粒待转染

6、。　　1.2.3细胞培养　　skov3细胞在含体积分数为0.10的胎牛血清、105U/L青霉素和100mg/L链霉素的RMPI1640培养液中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中常规培养。每天观察记录细胞的生长状态。　　1.2.4转染　　采用HifectinⅡ转染试剂转染，按操作说明优化转染条件。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。正常对照组细胞不进行任何干预；非特异性转染组转染由Ambion公司质粒试剂盒所提供的非特异性质粒；特异性转染组转染pEGFRshRNA质粒。转染前1d

7、将细胞接种至6孔板，每孔5×105个细胞，转染当天细胞约80％汇合，将构建好的质粒与HifectinⅡ混合成转染复合物(质粒质量∶HifectinⅡ体积=1∶1.5),加入细胞中轻柔摇匀，置于37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中孵育24h后1∶2传代，加300mg/L的G418筛选，3周后获抗G418的阳性克隆，继续扩增培养用于后续实验。　　1.2.5RTPCR检测转染前后skov3细胞EGFRmRNA的表达　　按Trizol试剂说明书的要求提取细胞总RNA，按ReverseTranscriptio

8、nSystem的说明书采用特异性下游引物法反转录成cDNA。EGFR上游引物：5′AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT3′；EGFR下游引物：5′GGAAGTCCATCGACATGTTGCT3′,扩增产物长262bp。以βactin为内参照，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环25次后，72℃延伸10min。15g/L的琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射观察仪