rna干扰ercc1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响

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1、RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响【关键词】RNA干扰；,,ERCC1基因；,,卵巢癌；,,耐药　　摘要：目的：观察RNA干扰沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞耐药的影响。方法：体外合成靶向于ERCC1基因的小干扰RNA(ERCC1-siRNA),用脂质体法转染至卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP,RT-PCR方法检测转染前后细胞内ERCC1mRNA的表达，TT实验检测转染前后COC1/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。结果：转染ERCC1-siRNA后，COC1/DDP细胞中ERCC1基因

2、的mRNA和蛋白表达均明显减少。RNA干扰联合顺铂用药能明显提高COC1/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论：RNA干扰ERCC1基因能明显抑制COC1/DDP细胞内ERCC1基因mRNA和蛋白的表达，增加COC1/DDP细胞对化疗药顺铂的敏感性。　　关键词：RNA干扰；ERCC1基因；卵巢癌；耐药　　EffectonCytotoxicitybyRNAiERCC1GeneExpressioninOvarianCancerCelILine　　Abstract：Objective:Tostudytheef

3、fectondrugresistancebyRNAimediatedERCC1genesilencinginovariancancercellline.Method:SmallinterferenceRNAtargetedERCC1genei-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)andeasuretheinhibitionbinedRNAandproteinlevelsofERCC1geneinCOC1/D

4、DPcellsotherapy．Conclusion:ERCC1-siRNAcouldreducetheexpressionofERCC1geneandincreasethesensitivitytocisplatininCOC1/DDPcell.　　KeyRNA水平沉默靶基因，阻断基因的表达［2］。由于RNAi具有序列特异性和高效性，目前已成为抗肿瘤基因治疗的有效手段。本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点，针对ERCC1基因设计合成小干扰RNA（s

5、iRNA），在脂质体的介导下转染人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP，以RT-PCR及TT实验检测RNA干扰ERCC1基因后卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP对顺铂敏感性的改变，以探讨逆转卵巢癌化疗耐药的新方法。　　1材料与方法　　1.1材料与试剂：卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP购自中国典型培养物保藏中心。RNA干扰试剂盒购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000、TrizolRNA提取试剂盒、M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。RPMI-16

6、40培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。ERCCI鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP、Actin(1～19)多克隆抗体SANTACRUZ公司。　　1.2细胞培养：COC1/DDP细胞常规培养于含10％胎牛血清，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，37℃、5％CO2孵箱培养。在培养过程中加顺铂1mg/L以维持耐药性，实验前3d停药。　　1.3小干扰RNA的构建：根据siRNA设计原则和GeneBank中ERCC1基因的编码序列，选择以AA开始长21nt的核苷酸序列

7、为反义模板，与之互补链为正义模板，两者3'端均加上T7启动子引物，序列为：5'CCTGTCTC3'。ERCC1-siRNA模板序列的两条链分别为5'AAGGAAGAAATTTGTGATACCCCTGTCTC3'和5'AAGGTATCACAAATTTCTTCCCCTGTCTC3'。两条链经体外转录合成dsRNA。　　1.4siRNA的转染：细胞接种于含10％胎牛血清、50U／ml青霉素、50mg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、5％CO2培养箱孵育，实验前无药培养3d。取对数生长期细

8、胞，调整细胞浓度为1.5×105／ul，接种于24孔板中(每孔500ul)，用脂质体转染试剂Lipofectamine2000,按试剂盒说明进行操作，转染ERCC1-siRNA后48h收集细胞做以下实验。　　1.5半定量RT-PCR检测转染前后COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA的表达：从未转染和转染48h后的细胞中提取细胞总RNA，按逆转录(RT)试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。聚合酶链(PCR)反应，上游引物:5'TCGATCCCTCTGCAGTCTTT3',下游引物:5