糖尿病视网膜病变HMGB1信号通路分子的表达及盐酸小蘖碱对其干预作用的研究.pdf

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1、分类号：R774密级：公开学校代码：11065学号：y0115130132专业博士学位论文糖尿病视网膜病变HMGB1信号通路分子的表达及盐酸小蘖碱对其干预作用的研究作者姓名付浴东指导教师王大博（教授）专业领域眼科学培养单位医学部临床学院答辩日期2018年5月16日糖尿病视网膜病变HMGB1信号通路分子的表达及盐酸小蘖碱对其干预作用的研究摘要目的：糖尿病视网膜病变与炎症反应相关，HMGB1作为炎症介质参与糖尿病视网膜病变的作用机制不详。本研究旨在明确HMGB1在糖尿病视网膜病变患者眼部及全身的表达，通

2、过建立SD大鼠糖尿病模型及应用盐酸小蘖碱对其进行干预，探讨HMGB1信号通路分子在糖尿病视网膜病变中的表达及盐酸小蘖碱对其病程进展的干预作用。方法：1.2016年6月至2017年6月我院眼科明确诊断并实施手术的糖尿病性增殖性视网膜病（26例）及特发性黄斑前膜病（18例），术前收集患者血清，术中收集房水、玻璃体液及纤维血管膜/黄斑前膜组织，应用免疫组化和免疫印迹法（Westernblot）检测纤维血管膜/黄斑前膜组织中的HMGB1蛋白的分布和表达量；荧光定量PCR（qPCR）检测纤维血管膜/黄斑前膜组

3、织中HMGB1mRNA的水平；ELISA法检测血清、房水及玻璃体液中HMGB1蛋白的水平，明确两组患者器官及机体中HMGB1表达差异。2.健康SD大鼠随机分为对照组(80只)及糖尿病组（80只），糖尿病组通过腹腔注射STZ诱导SD大鼠糖尿病模型。分别于4wk、8wk、16wk、24wk不同时间点观察记录两组大鼠体重及血糖变化情况后，处死对应组别糖尿病大鼠，对照组处死相同数量大鼠作对照。视网膜病理切片HE及TUNEL染色，观察视网膜形态学改变及凋亡情况。活体视网膜铺片EB染色及渗漏值测量观察视网膜屏障

4、通透性改变。免疫组化和Westernblot检测视网膜组织HMGB1、RAGE、NF-κB、Occludin蛋白分布及表达量。ELISA法检测VEGF表达量及NF-κB活性改变。3.健康SD大鼠随机分为对照组（20只）、糖尿病（20只）及盐酸小蘖碱（Berberine,BBR）干预组（40只）。糖尿病组及BBR干预组通过腹腔注射STZ诱导糖尿病模型后，干预组根据干预药物剂量分为BBR150（mg/kg）（20只）及BBR300（mg/kg）（20只）两个亚组。于4wk、8wk、16wk、24wk不同

5、时间点观察记录三组大鼠体重及血糖变化情况。24wk时处死三组大鼠，HE及TUNEL染色观察BBR150及300干预组BBR对糖尿病大鼠视网膜形态学改变及凋亡的影响。活体视网膜铺片EB染色及渗漏值测量观察BBR对糖尿病大鼠视网膜屏障通透性改变的干预作用。免疫组化和Westernblot检测观察糖尿病大鼠视网膜组织HMGB1、RAGE、NF-κB、OccludinI蛋白表达的改变，分析不同剂量BBR对其的干预作用。Elisa法检测BBR对糖尿病大鼠视网膜组织VEGF表达量及NF-κB活性的干预作用。EL

6、ISA检测体外BBR对HMGB1/RAGE结合的抑制作用。结果：1.免疫组化结果显示，纤维血管膜及黄斑前膜组织HMGB1均在胞浆中表达，光密度值分别为（53.28±23.47）和（22.81±6.39），两者比较差别有统计学意义（p<0.01）；免疫印迹法结果显示，纤维血管膜中的HMGB1蛋白表达水平较黄斑前膜组织明显升高，表达量分别为（1.47±0.32）和（0.53±0.14），差别有统计学意义（p<0.01）；同样，纤维血管膜中的HMGB1mRNA水平也较黄斑前膜明显升高，相对表达量分别为（0

7、.39±0.22）和（0.18±0.14），差别有统计学意义（p<0.05）；糖尿病视网膜病变患者眼部房水及玻璃体液中的HMGB1蛋白表达高于黄斑前膜患者，且这种变化也体现在外周血清中，两组比较差别均有统计学意义（p<0.05）。2.实验前对照组及糖尿病组血糖及体重无明显差异（p>0.05）。糖尿病组血糖值均高于对照组，而体重均低于对照组，差别均有统计学意义（p<0.01）；视网膜铺片对照组整个视野视网膜外观正常，糖尿病8wk微血管瘤形成，糖尿病16wk、24wk可见荧光局部渗漏、无灌注区形成。对照

8、组视网膜EB渗漏值为（1.82±0.21）ng/mg，糖尿病组8wk、16wk、24wk时，视网膜渗漏值分别为（4.25±10.59）、（9.26±1.01）、（11..35±1.38）ng/mg，与对照组比较差别均有统计学意义（p<0.05）；HE染色对照组大鼠组织结构正常，4wk、8wk时仅见层间距增大，未见内皮细胞突破内界膜，糖尿病组16wk、24wk时可见视网膜细胞排列混乱，毛细血管内皮细胞突破内界膜；TUNEL染色对照组未见凋亡细胞阳性表达，糖尿病组4wk时